Development of human osteogenic cell sheets co-cultured with endothelial and pericyte-like cells

• Autor(a) principal: Mendes, Luís Filipe Freitas
• Data de Publicação: 2015
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: eng
• Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
• Texto Completo: http://hdl.handle.net/10348/5296
• topic: Engenharia de tecidos; Regeneração óssea; Técnicas de cultura de células; Scaffolds

Recentemente, o uso de cell sheets tornou-se uma realidade na área da engenharia de tecidos, existindo alguns estudos que provam a viabilidade desta tecnologia como alternativa aos tradicionais métodos baseados no uso de scaffolds. O uso de cell sheets permite não só dispensar o uso de biomateriais de suporte mas também criar substitutos de tecidos, ex-vivo, com uma organização celular própria mantendo altamente coesivas as adesões célula-célula e as interacções com a matriz extracelular. Contudo, a evolução desta tecnologia tem sido limitado por algumas das barreiras que têm vindo a impedir o progresso das estratégias tradicionais de engenharia de tecidos, nomeadamente a ausência de uma vasculatura apropriada que permita a integração dos constructs in vivo. Deste modo, este trabalho propõe a criação de um construct baseado na tecnologia de cell sheets, obtido co-cultivando células osteogénicas, endoteliais e com marcadores pericíticos, com o objetivo de promover a vascularização de tecido ósseo novo e o grau de maturação e estabilidade da rede vascular formada. Numa primeira fase deste trabalho começou-se por otimizar as condições de cultura celular para o fabrico de cell sheets osteogénicas a partir de células mesenquimais humanas derivadas da medula óssea (hBMSCs). Esta otimização permitiu evoluir em seguida para o design de um sistema de co-cultura de células endoteliais da veia do cordão umbilical (HUVECs) e células com potencial perivascular (CD146+), criando um modelo para a vascularização de constructs produzidos in vitro com potencial para aplicação em engenharia de tecido ósseo. A medula óssea foi anteriormente proposta como uma possível fonte de células com potencial perivascular, nomeadamente as que expressam o marcador celular CD146. Deste modo, as hBMSCs isoladas da medula óssea foram cultivadas em diferentes meios de cultura e caracterizadas tendo em conta a expressão de CD146 e dos marcadores associados a células mesenquimais, CD90, CD73 e CD105. Os resultados de citometria de fluxo demonstraram que a adição de TGF-β1 ao meio de cultura provoca um aumento de expressão do marcador CD146 nas hBMSCs, de aproximadamente 50% para um valor superior a 97%. Simultaneamente, verificou-se que alterações na expressão de CD146 estão associadas a alterações da morfologia celular. A análise das co-culturas por imunocitoquímica mostrou que as células induzidas a expressar CD146 e as HUVECs foram capazes de migrar naturalmente e de se organizar sobre uma superfície rica em colagénio composta por células osteogénicas confluentes, sugerindo a existência de um cross-talk eficiente entre todas as células que compõem o sistema de co-cultura. A capacidade do construct formar, in vivo, tecido osteo-comprometido, vascularizado e funcional foi avaliada após a transplantação subcutânea do construct em ratinhos. A análise de imunohistoquímica das cell sheets transplantadas revelou a integração das HUVECs com a rede vascular do hospedeiro assim como o potencial osteogénico do construct, tal como comprovado pela detecção da expressão da osteocalcina. Adicionalmente, a análise do diâmetro dos vasos positivos para o marcador CD146 revelou um aumento da média do diâmetro dos vasos na condição experimental, o que confirma a hipótese colocada e reforça a relevância do modelo proposto na maturação e estabilização dos vasos sanguíneos formados.