Solute carrier transporters (SLCs) as possible drug targets for cystic fibrosis
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| Data de Publicação: | 2017 |
| Tipo de documento: | Dissertação |
| Idioma: | eng |
| Título da fonte: | Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) |
| Texto Completo: | http://hdl.handle.net/10451/31226 |
Resumo: | Tese de mestrado em Bioquímica, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2017 |
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Solute carrier transporters (SLCs) as possible drug targets for cystic fibrosisFibrose quísticaCFTRSLC264SLC26A9Canais de C1 alternativosTeses de mestrado - 2017Domínio/Área Científica::Ciências Naturais::Ciências QuímicasTese de mestrado em Bioquímica, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2017A fibrose quística (FQ) é a doença genética autossómica recessiva mais comum na população caucasiana afetando cerca de 1 em 25,000-6,000 recém-nascidos e com cerca de 85,000 pessoas afetadas em todo o mundo. Esta doença é causada por uma mutação no gene que codifica para a proteína CFTR, (do inglês Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator). De entre as 2000 mutações encontradas no gene da CFTR, a mais comum e mais severa, é a deleção da fenilalanina na posição 508, com uma incidência de aproximadamente 85 % nos pacientes com FQ. A CFTR é uma proteína responsável pelo transporte de cloreto (Cl-) e bicarbonato (HCO3-) na membrana apical de várias células epiteliais, tendo um papel fundamental na regulação de processos de secreção e absorção na superfície do epitélio. Para além da sua função no transporte de aniões, a CFTR tem um papel importante no controlo de outros canais iónicos, destacando-se a regulação inibitória da absorção de sódio pela interação com a proteína ENaC, (do inglês Epithelial Na+ channel). Nos pacientes com fibrose quística, a presença de CFTR não funcional conduz a um desequilíbrio na secreção de cloreto e na absorção de sódio. Consequentemente, ocorre uma desidratação do líquido superficial das vias respiratórias (do inglês airway surface liquid (ASL)) com um progressivo aumento da viscosidade do muco e redução do batimento dos cílios. Desta forma, fica comprometido o processo de remoção de bactérias e outros patógenos. Os pacientes apresentam recorrentes infeções bacterianas que progressivamente se traduzem numa inflamação crónica, sendo esta a principal causa de mortalidade dos pacientes com FQ (80 %). Para além disso, os pacientes apresentam elevada concentração de cloreto no suor, sendo esta caraterística usada como método de diagnóstico na clínica. Frequentemente, exibem também outros fenótipos como: insuficiência pancreática e infertilidade masculina. Com menos frequência destaca-se o aparecimento de diabetes relacionada com FQ, ileus meconial e obstrução intestinal e hepática. Para além da regulação da proteína ENaC, a CFTR regula outros canais iónicos na superfície do epitélio, tais como: os canais de Cl- ativados por cálcio (CaCC) e os transportadores pertencentes à família SLC26A (do inglês solute carrier). As proteínas SLC26 são uma grande família de transportadores iónicos que codifica 11 genes, SLC26A1-SLC26A11, encontrados em todos os organismos. Estas proteínas apresentam elevada semelhança estrutural apesar da notável diferença no padrão de expressão. Funcionam como canais e/ou trocadores aniónicos de uma grande variedade de substratos na superfície das células epiteliais, tendo um papel essencial na composição e regulação do pH dos fluidos secretados. Os estudos mais recentes realçam o papel destes transportadores no controlo do transporte iónico na superfície do epitélio, bem como a sua interação e ação recíproca com a proteína CFTR. Consequentemente, no âmbito da fibrose quística dois membros desta família, SLC26A4, também conhecida como Pendrina, e SLC26A9 surgiram como canais alternativos à CFTR e potenciais alvos farmacológicos. A proteína SLC26A4 funciona como um trocador aniónico eletroneutro antiporte de uma grande variedade de substratos, sendo, no entanto, a troca de Cl- e HCO3- o modo de função predominante. Apesar da CFTR e o SLC26A4 poderem ambos transportar HCO3-, o papel de cada um deles é específico: a pendrina assegura o controlo da composição e pH do líquido secretado enquanto a CFTR regula a taxa de secreção do líquido. Por outro lado, a proteína SLC26A9 funciona como um canal de Cl- com mínima condutância para o HCO3-. A interação e regulação entre a CFTR e a SLC26A9 tem sido vastamente estudada e sabe-se que o SLC26A9 aumenta o transporte de Cl- dependente da ativação da proteína cinase A da CFTR. Para além disso, a presença de SLC26A9 aumenta a expressão de CFTR na membrana plasmática, o que poderá indicar um papel deste canal iónico na biogénese e/ou estabilidade da CFTR. SLC26A9 é também descrito como um gene modificador de FQ. Nomeadamente, um polimorfismo no gene SLC26A9 está associado com uma maior suscetibilidade e severidade de patologias associadas com a fibrose quística, como ileus meconial, diabetes relacionada com FQ e destruição pancreática pré-natal. O principal objetivo deste trabalho é a identificação de novos reguladores destes dois membros da família SLC26A, SLC26A4 e SLC26A9 bem como estudar a interação destes transportadores com a CFTR. Desta forma o trabalho foi dividido em cinco tarefas principais: i) determinar a influência do genótipo da CFTR nos níveis de mRNA bem como na respetiva localização subcelular em amostras de pacientes; ii) Produção de constructos destas proteínas com dois tags para serem usados como reporters de tráfego iii) Produção de novas linhas celulares que expressem os constructos desenvolvidos para o uso em ensaios de microscopia de fluorescência high-throughput; iv) Usar screens com bibliotecas de siRNAs para identificar novos genes envolvidos na regulação destas proteínas e que possam ser novos e potenciais fármacos no tratamento de FQ; v) Estudar as interações funcionais entre estas proteínas e a CFTR na sua versão normal ou mutada através da localização e função das proteínas em condições de presença ou ausência de CFTR. A localização das proteínas em amostras de pacientes com FQ ou control (sem FQ) foi analisada por imunofluorescência e os resultados mostram que a localização de SLC26A4 e SLC26A9, na membrana plasmática, não é afetada pela presença de CFTR normal ou mutada. O estudo do efeito do genótipo nos níveis transcricionais de SLC26A4 e SLC26A9, realizado por quantitativo (q)RT-PCR em CFBE wt- ou F508del-mCherry-Flag-CFTR e em células nasais de indivíduos com FQ e sem FQ, mostra que, embora os níveis de mRNA pareçam ser ligeiramente elevados em pacientes com fibrose quística essa diferença não é significativa. Os construtos com dois tags foram produzidos para ambas as proteínas e o seu estudo no tráfego e processamento das proteínas para a membrana plasmática foi avaliado. Embora com o construto original de SLC26A9 não fosse possível detetar a expressão na membrana plasmática, devido à ausência do tag 3-HA no espaço extracelular, numa segunda tentativa foi possível detetar a expressão na membrana plasmática de ambos os construtos em células CFBE. A terceira tarefa foi apenas concluída para a proteína SLC26A9. O construto foi clonado no vetor lentiviral pLVX-TRE3G e foram produzidas três linhas celulares que sobreexpressam eGFP-3xHA-SLC26A9: 1) CFBE parental; e co-expressão com 2) wt-mCherry-Flag-CFTR; ou 3) F508del-mCherry-Flag-CFTR SLC26A9 3-HA GFP, sob controlo de um promotor indutivel (Tet-ON). Estas novas linhas celulares que sobre-expressam o construto eGFP-3xHA-SLC26A9 foram analisadas por técnicas de imunofluorescência e por Western Blot. A expressão de eGFP-3xHA-SLC26A9 na membrana plasmática foi detetada em todas as linhas celulares, concluindo-se assim não ser dependente da expressão de CFTR. Por fim, foi feito um screen preliminar de uma pequena biblioteca de siRNAs que afetam 206 genes conhecidos por aumentar o tráfego da proteína F508del-CFTR para a membrana e genes que codificam para proteínas que fazem parte do interactoma da CFTR, usando as células que sobre-expressam apenas eGFP-3xHA-SLC26A9. De entre os 81 genes que afetam o tráfego da proteína SLC26A9 para a membrana plasmática: 52 deles aumentam a expressão desta proteína na membrana plasmática enquanto os restantes 29 inibem a sua expressão. Os resultados do screen mostram que o tráfego da proteína SLC26A9 para a membrana plasmática é afetado por genes envolvidos em diversos processos biológicos tais como: vias de transdução de sinal, transporte iónico, organização do citoesqueleto, morte celular programada, regulação positiva da comunicação célula-célula, entre outros. Para além disso, estes resultados demonstram que muitos dos genes envolvidos no controlo do tráfego da proteína CFTR também afetam o tráfego da proteína SLC26A9 sugerindo assim uma corelação entre as vias de tráfego destas proteínas. Posteriores validações dos resultados obtidos podem futuramente potenciar uma nova estratégia para o desenvolvimento de novas terapias para a FQ com recurso a canais de Cl- e HCO3- alternativos. Para além disso, o melhor conhecimento do normal funcionamento e regulação destes dois membros, SLC26A4 e SLC26A9, poderá evidenciar novas vias de regulação que poderão compensar a ausência de CFTR.Cystic Fibrosis (CF) is the most lethal autosomal recessive disorder in the Caucasian population, affecting 1: 25,00-6,000 new-borns and with about 85,000 affected people worldwide. CFTR gene encodes a cAMP regulated chloride (Cl-) and bicarbonate (HCO3-) anion channel expressed in apical membrane of epithelial cells of a variety of tissues. Mutations in the CFTR gene affect the normal processing, trafficking and function of CFTR. F508del, deletion of phenylalanine at position 508, is the most common mutation in CF patients and it is also associated with a severe clinical phenotype. CFTR protein pays a key role in the regulation of Cl- and HCO3- transport. Additionally, CFTR regulates other ion channels, such as the Epithelial Sodium (Na+) Channel (ENaC) and it is also described as a regulator of several SLC26A family members. SLC26 proteins are a large family of anion transports encoded by 11 genes, SLC26A1-SLC26A11, found in all forms of life. These proteins can act as anion exchangers and/or channels of a variety of substrates in epithelial cells, where they have an essential role in the composition and pH regulation of secreted fluids. The most recent studies have identified and highlighted the role of these transporters in lung physiology, which makes these transporters novel candidates as pharmacological targets for CF. Among the most promising ones are SLC26A4/pendrin and SLC26A9. SLC26A4 acts as an electroneutral anion exchanger of several substrates, but the Cl-/ HCO3- exchange mode is described as the most predominant. Although both pendrin and CFTR have the ability to transport HCO3-, it was recently proposed that pendrin controls the composition and pH of secreted fluids, while CFTR regulates the rate of secreted fluid. In contrast, SLC26A9 functions as Cl- channel with minimal HCO3- conductance and it was reported that it regulates the activity of CFTR, namely leading to an increase in Cl- currents after stimulation with forskolin when both channels are expressed vs CFTR alone. Furthermore, it was also proposed that the presence of CFTR is essential for SLC26A9 activity. However, the physical and functional interactions between SLC26A4/A9 and CFTR are not completely understood. The main objective of this MSc project was to identify novel regulators of the two above members of SLC26 family describe above (SLC26A4 and SLC26A9), and to study their functional interaction with CFTR. To achieve these goals, five tasks were proposed: i) to determine the influence of the CFTR genotype on SLC26A4/A9 mRNA levels and also on therespective protein subcellular localization in CF patients materials; ii) To generate double-tagged SLC26A4/SLC26A9 constructs to be used as traffic reporters; iii) To produce inducible novel cell lines stably expressing these double-tagged constructs to develop microscopy-based traffic assays; iv) To use such assays in siRNA microscopy screens to identify novel genes involved in regulating the traffic of these proteins that may constitute potential drug targets for CF; and finally v) to look for physical and functional interactions with normal and mutant CFTR by determining the localization and function of the protein upon overexpression and downregulation of CFTR. The localization of both proteins in lung tissue from CF and non-CF individuals was analysed by immunostaining and the results showed that the localization of SLC26A4 and SLC26A9 - mostly at the plasma membrane (PM) – does not seem to be affected by the presence of wt- or mutant CFTR. Quantitative (q)RT-PCR was employed to determine whether the CF genotype affects the transcript levels of SLC26A4 and SLC26A9 in nasal cells from CF and non-CF individuals and also in CFBE stably expressing wt- or F508del-mCherry-Flag-CFTR. Data shown here indicate that although mRNA levels of both transporters seem to be slightly elevated in the lung of CF vs non-CF individuals (and those of SLC26A9 in F508del-CFTR CFBE cells), these differences are not statistically significant. The double tagged constructs were produced for both proteins and their influence on the normal trafficking and processing of the proteins to the PM was assessed. Although an original construct of SLC26A9 did not expose the 3xHA to the extracellular space, in a second attempt this was successful and it was possible to detected PM expression of both constructs in CFBE cells by transient transfections. The identification of traffic regulators (task 3) was completed for SLC26A9. The double-tagged construct was cloned into the lentiviral vector pLVX-TRE3G with inducible (Tet-ON) expression and three different CFBE cells lines overexpressing eGFP-3xHA-SLC26A9 3-HA were produced, namely: 1) parental CFBE; and co-expressing either 2) wt-mCherry-Flag-CFTR; or 3) F508del-mCherry-Flag-CFTR. These three novel eGFP-3xHA-SLC26A9 expressing CFBE cells were characterized by both immunostaining and Western Blot techniques. Inducible eGFP-3xHA-SLC26A9 was found to be expressed at the PM and our data also show that its expression does not appear to be dependent on CFTR expression. Finally, a siRNA microscopy screen using a small siRNA library targeting 206 genes, reported as enhancers of F508del traffic or to interact with CFTR, was performed for CFBE eGFP-3xHA-SLC26A9 cells. Data from this siRNA screen suggest that SLC26A9 traffic to the plasma membrane is affected by genes involved in several biological processes like signal transduction, ion transport, cytoskeleton organization, programmed cell death, positive regulation of cell communication, among others. Moreover, additional studies and further validation of these results could potentially constitute a new approach for CF therapy involving alternative Cl- channels.Amaral, Margarida,1958-Repositório da Universidade de LisboaPetinga, Íris Lameiro2019-10-28T01:30:41Z201720172017-01-01T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/31226TID:201857200enginfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2023-11-08T16:24:32Zoai:repositorio.ul.pt:10451/31226Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T21:46:44.690946Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse |
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