A novel reporter of Fgf5 expression to monitor the "stemness" ground state in mouse embryonic stem cells

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Honório, Inês Agapito, 1988-
Data de Publicação: 2011
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: eng
Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
Texto Completo: http://hdl.handle.net/10451/6411
Resumo: Tese de mestrado. Biologia (Biologia Molecular e Genética). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2011
id RCAP_085845aba7d8a2b92dc31e4436b76a47
oai_identifier_str oai:repositorio.ul.pt:10451/6411
network_acronym_str RCAP
network_name_str Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
repository_id_str 7160
spelling A novel reporter of Fgf5 expression to monitor the "stemness" ground state in mouse embryonic stem cellsEmbriologia molecularCélulas estaminais embrionáriasExpressão génicaTeses de mestrado - 2011Tese de mestrado. Biologia (Biologia Molecular e Genética). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2011Embryonic stem (ES) cells are characterized by their self-renew and pluripotency properties – the stemness state. A complex gene regulatory network (GRN), with three core transcription factors, NANOG, OCT4 and SOX2 (NOS network), underlies this state, but despite extensive work on this GRN, little is still known about how these factors interact in order to maintain it. Recent work has shown that NANOG expression is heterogeneous in ES cells, while OCT4 and SOX2 seem to be expressed more homogeneously. In addition, NANOG-negative ES cells have a reduced capacity to self-renew and a tendency to differentiate, while cells that constitutively express high levels of Nanog are apparently resistant to differentiation stimuli. These facts suggest that NANOG has a crucial functional role in stemness maintenance and show the necessity of understanding how different levels of Nanog expression control an ES cell’s response to differentiation cues. Previous studies with FGF/ERK inhibitors have shown that the inhibition of this pathway enhance ES cells growth1. Thus, once activation of ERKs apparently impairs self-renewal, FGF/ERK pathway is one of the cues that has to be blocked in order to maintain ES cells in the stemness state and prevent differentiation. Since both the NOS network and the FGF/ERK pathway play a decisive role in controlling the stemness potential of ES cells, it is essential to better understand the relationship between the two pathways. To achieve this, ES cell lines that allow the monitoring, in real-time, of the stemness and differentiation potentials are essential. In this work, I have developed novel ES cell lines that allow the real-time visualization of NANOG and FGF5 expression, the first as an indicator of stemness and the second as a marker of commitment to differentiation. These cell lines have been validated regarding their stemness potential and the adequacy of the reporters and shall help to unveil the complex gene network behind stemness by the analysis of movies in which the dynamic of the genes may be followed.Células estaminais embrionárias são um tipo particular de células estaminais com origem no botão embrionário do blastocisto e que quando mantidas in vitro, sob condições de cultura específicas, têm a capacidade de manter a sua “estaminalidade” que se resume a duas características fundamentais: a competência para diferenciação em várias linhagens (pluripotencialidade), e a capacidade de auto-renovação. Estas células, devido às suas características têm um enorme potencial terapêutico, mas para que tal aconteça é imperativo perceber de que forma emergem estas células com propriedades tão específicas. Na origem da estaminalidade encontra-se uma rede genética complexa, cujo núcleo central pode ser reduzido a três genes codificando os factores de transcrição: NANOG, OCT4 e SOX2 (NOS). No entanto, continua por desvendar de que forma a interacção concertada destes factores mantém o estado estaminal. Sendo assim, actualmente, o desafio reside na compreensão do comportamento dinâmico da rede NOS, bem como nas propriedades emergentes que estão na base do estabelecimento e manutenção do estado “estaminal”. Estudos recentes2 indicam que a sinalização FGF paralela pelas vias JAK/STAT e PI3K mantêm a pluripotência nas ES enquanto a sinalização ERK a destabiliza. Isto sugere que as vias activadas por FGFs possam ter funções antagónicas, uma vez que a sinalização Erk é também uma das vias activadas por FGFs responsáveis pela saída para diferenciação. Dado que tanto a rede regulatória NOS como a via de sinalização FGF/ERK têm um papel fundamental na decisão das células ES iniciarem a diferenciação ou de se manterem num estado estaminal, torna-se evidente a necessidade da análise da interacção destas duas vias. Mais especificamente, torna-se essencial, compreender de que forma as flutuações dos níveis de expressão de Nanog conduzem a variações no estado de estaminalidade das células ES, bem como influenciam a sua receptividade aos diferentes estímulos de diferenciação, tais como os proporcionados pela via FGF/ERK. Para atingir este objectivo, é crucial monitorizar, em tempo real, os níveis de expressão de Nanog em células ES individualizadas e, simultaneamente, medir a capacidade de cada célula para entrar em diferenciação. Para tal, é necessário monitorizar o gene Nanog (de modo a verificar o seu carácter oscilatório) e o gene Fgf5 (como repórter da actividade FGF/ERK e da decisão de diferenciação). A ferramenta utilizada foi a construção de duas novas linhas celulares (NdF e E14F) com repórteres fluorescentes dos dois genes de interesse. Uma linha celular que contem um repórter fluorescente de NANOG (linha celular Nd), foi anteriormente estabelecida e validada no laboratório27. Durante a realização deste projecto, desenhou-se um BAC para o gene Fgf5, que possa ser electroporado na linha celular Nd, de forma a produzir uma linha celular que seja duplamente repórter da actividade de Nanog e de Fgf5. Também foi construída uma linha celular simples com um único repórter da actividade do gene Fgf5 introduzindo o BAC FGF5 na linha não modificada E14tg2a. Para preparar o BAC foi inicialmente feita uma tripla ligação de duas metades da cassete FGF5 e do vector pKS. A cassete FGF5 completa foi posteriormente introduzida no BAC FGF5, onde se encontram os elementos promotores do gene, por recombinação homóloga. Anteriormente à introdução do BAC na linha celular Nd, teve que se proceder a um passo de remoção da cassete de selecção das células para que fosse possível, posteriormente, fazer uma selecção utilizando o antibiótico kanamicina cujo gene de resistência existe tanto na cassete do NANOG como na cassete do FGF5. O BAC foi introduzido nas linhas celulares Nd e E14tg2a por electroporação e novas linhas celulares foram estabelecidas e validadas. Por último, a linha celular dupla NdF foi utilizada para monitorizar, em tempo real a expressão dos genes Nanog e Fgf5 durante um período de 12 horas. Nos filmes realizados observam-se flutuações nos níveis de expressão do repórter Nanog:VNP (Venus-NLS-PEST), com células que inicialmente não expressam Nanog a aumentarem os seus níveis de expressão e novamente a voltarem a adquirir um nível basal de expressão. Estas observações indicam um comportamento dinâmico do gene Nanog endógeno, comportamento esse que pode ajudar a explicar o modo de funcionamento da intrincada rede de factores de transcrição subjacente ao estado estaminal. Relativamente aos níveis de expressão do gene Fgf5 inferidos pelos filmes que foram realizados em células NdF, estes parecem ser demasiado baixos para poderem ser monitorizados utilizando um repórter da actividade do gene. Outra hipótese possível é o repórter produzido ser demasiado instável e ocorrer uma degradação precoce do mRNA impedindo que este seja traduzido. Os dados obtidos sugerem que as linhas celulares criadas neste trabalho podem ser utilizadas para monitorizar a saída do estado estaminal, altura em que as células mES iniciam a diferenciação, no entanto, é necessário prosseguir com a completa validação do repórter para o comprovar.Abranches, ElsaDuarte, Júlio António Bargão, 1957-Repositório da Universidade de LisboaHonório, Inês Agapito, 1988-2012-06-01T17:38:14Z20112011-01-01T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/6411enginfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2023-11-08T15:48:56Zoai:repositorio.ul.pt:10451/6411Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T21:31:33.633518Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse
dc.title.none.fl_str_mv A novel reporter of Fgf5 expression to monitor the "stemness" ground state in mouse embryonic stem cells
title A novel reporter of Fgf5 expression to monitor the "stemness" ground state in mouse embryonic stem cells
spellingShingle A novel reporter of Fgf5 expression to monitor the "stemness" ground state in mouse embryonic stem cells
Honório, Inês Agapito, 1988-
Embriologia molecular
Células estaminais embrionárias
Expressão génica
Teses de mestrado - 2011
title_short A novel reporter of Fgf5 expression to monitor the "stemness" ground state in mouse embryonic stem cells
title_full A novel reporter of Fgf5 expression to monitor the "stemness" ground state in mouse embryonic stem cells
title_fullStr A novel reporter of Fgf5 expression to monitor the "stemness" ground state in mouse embryonic stem cells
title_full_unstemmed A novel reporter of Fgf5 expression to monitor the "stemness" ground state in mouse embryonic stem cells
title_sort A novel reporter of Fgf5 expression to monitor the "stemness" ground state in mouse embryonic stem cells
author Honório, Inês Agapito, 1988-
author_facet Honório, Inês Agapito, 1988-
author_role author
dc.contributor.none.fl_str_mv Abranches, Elsa
Duarte, Júlio António Bargão, 1957-
Repositório da Universidade de Lisboa
dc.contributor.author.fl_str_mv Honório, Inês Agapito, 1988-
dc.subject.por.fl_str_mv Embriologia molecular
Células estaminais embrionárias
Expressão génica
Teses de mestrado - 2011
topic Embriologia molecular
Células estaminais embrionárias
Expressão génica
Teses de mestrado - 2011
description Tese de mestrado. Biologia (Biologia Molecular e Genética). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2011
publishDate 2011
dc.date.none.fl_str_mv 2011
2011-01-01T00:00:00Z
2012-06-01T17:38:14Z
dc.type.status.fl_str_mv info:eu-repo/semantics/publishedVersion
dc.type.driver.fl_str_mv info:eu-repo/semantics/masterThesis
format masterThesis
status_str publishedVersion
dc.identifier.uri.fl_str_mv http://hdl.handle.net/10451/6411
url http://hdl.handle.net/10451/6411
dc.language.iso.fl_str_mv eng
language eng
dc.rights.driver.fl_str_mv info:eu-repo/semantics/openAccess
eu_rights_str_mv openAccess
dc.format.none.fl_str_mv application/pdf
dc.source.none.fl_str_mv reponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informação
instacron:RCAAP
instname_str Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informação
instacron_str RCAAP
institution RCAAP
reponame_str Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
collection Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
repository.name.fl_str_mv Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informação
repository.mail.fl_str_mv
_version_ 1799134205050880000

Registros relacionados