Impact of hormesis by antimicrobials in Stenotrophomonas maltophilia

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Serra, Joana Soares Baptista, 1987-
Data de Publicação: 2012
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: eng
Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
Texto Completo: http://hdl.handle.net/10451/7525
Resumo: Tese de mestrado. Biologia (Biologia Evolutiva e do Desenvolvimento). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2012
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spelling Impact of hormesis by antimicrobials in Stenotrophomonas maltophiliaMicrobiologiaResistência aos antibióticosResistência antimicrobianaTeses de mestrado - 2012Tese de mestrado. Biologia (Biologia Evolutiva e do Desenvolvimento). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2012Concentrações subinibitórias de antibióticos estão presentes na natureza, devido à contaminação por águas residuais ou pela sua produção pelos próprios microrganismos, assim como em compartimentos corporais durante uma antibioterapia. Ainda se desconhece o quão profundo é o impacto destas concentrações nas populações microbianas. Os elevados níveis antimicrobianos usados como terapia geram um bottleneck sobre estas populações. Contudo, as concentrações subinibitórias podem ter efeitos benéficos em agentes patogénicos oportunistas. Assim sendo, os antibióticos constituem um bom exemplo de hormese. Tanto em ambientes naturais como nosocomiais, a resistência antimicrobiana é um importante fenótipo para a sobrevivência bacteriana. Neste contexto, hipoteticamente, os efeitos benéficos das concentrações subinibitórias poderão ser ao nível da resistência antimicrobiana. No entanto, poucos são os estudos sobre o efeito da exposição a concentrações subinibitórias de antibióticos na selecção de resistência. Mais concretamente, ainda não foi estabelecida qualquer relação entre a exposição a concentrações estimulantes e o aumento de resistência. Poderão assim as concentrações estimulantes ser um potenciador de resistência em agentes patogénicos intrinsecamente resistentes com origem ambiental, como Stenotrophomonas maltophilia? Para avaliar o impacto da hormese na evolução e desenvolvimento de resistência antimicrobiana, na presença e ausência de um bottleneck, foi usada como modelo a estirpe D457 de S. maltophilia e uma biblioteca de 2160 mutantes isogénicos, construída a partir desta estirpe por inserção aleatória do transposão mini-Tn5-Tc. Inicialmente estabeleceram-se as condições óptimas para a ocorrência de hormese e bottleneck. De acordo com o modelo de hormese, o crescimento microbiano apresenta uma relação dose-resposta bifásica, com estimulação a baixas doses de antibióticos e inibição a elevadas doses. Neste trabalho, os resultados sugerem que o crescimento da estirpe D457 de S. maltophilia foi estimulado na presença de concentrações subinibitórias de norfloxacina, cloranfenicol e carbenicilina, que eram 16, 160 e 64 vezes inferiores às concentrações inibitórias mínimas (CIM) destes antibióticos, respectivamente. Reforça-se assim a importância do modelo de hormese na previsão de respostas para um intervalo de concentrações abaixo do nível inibitório. S. maltophilia, como agente oportunista de origem ambiental, está em contacto com concentrações subinibitórias na natureza e meios nosocomiais. Para compreender qual o impacto das concentrações estimulantes de antibióticos na evolução da sua resistência intrínseca, foram realizadas experiências de evolução até 157 gerações durante 1296 horas, na presença das concentrações estimulantes e inibitórias estabelecidas. Nestas experiências usaram-se a biblioteca de mutantes construída e a estirpe selvagem D457 de S. maltophilia. Nas experiências de evolução realizadas em 157 gerações, as populações que evoluíram sob exposição contínua a concentrações estimulantes apresentam no final um significativo aumento de resistência, em comparação com as populações que evoluíram na ausência de antibióticos. Assim, as populações expostas a concentrações estimulantes de norfloxacina apresentam CIMs 4 vezes superiores para este antibiótico, e as populações expostas a cloranfenicol e carbenicilina apresentam CIMs 3 vezes superiores para estes antibióticos, respectivamente. Esta exposição a concentrações estimulantes durante 157 gerações traduziu-se em CIMs 8, 6 e 4 vezes superiores para estes antibióticos, relativamente à geração inicial. Como a biblioteca de mutantes usada foi construída por mutagénese de inserção aleatória, genótipos susceptíveis e resistentes estavam provavelmente presentes nas populações da geração inicial, pelo que as experiências de evolução realizadas constituem experiências de competição ao longo de 157 gerações. Portanto, um enriquecimento dos genótipos resistentes, inicialmente presentes nas populações, poderá estar na base do aumento de resistência observado sob exposição a concentrações estimulantes. Uma hipótese alternativa é o enriquecimento de mutantes resistentes de novo. Considerando que as populações da biblioteca de mutantes e da estirpe selvagem que evoluíram na ausência de antibióticos apresentam um aumento similar de resistência, em comparação com as populações originais, isto sugere que mutações espontâneas conferidoras de resistência emergiram em ambos os tipos de populações. No entanto, as populações da biblioteca de mutantes que evoluíram sob exposição a concentrações estimulantes apresentam uma resistência significativamente maior que as populações evoluídas na ausência de antibióticos, assim como em comparação às populações originais. Assim sendo, as concentrações estimulantes poderão ser responsáveis por mutações de novo que conferem resistência e não emergiram espontaneamente. Daqui resultam duas hipóteses: a associação entre estas mutações de novo e a selecção dos genótipos presentes na biblioteca de mutantes; ou um efeito sinergético entre as mutações de novo e as mutações espontâneas. Em qualquer um destes casos, as mutações e genótipos enriquecidos sob concentrações estimulantes não devem estar associados a elevados custos de fitness, pois caso contrário provavelmente teriam desaparecido. A observação que as concentrações estimulantes podem seleccionar elementos de resistência entre populações microbianas sugere que o aumento de resistência não foi um evento estocástico. A importância de se ter usado uma biblioteca de mutantes neste trabalho reside no facto de, no caso dos elementos de resistência terem derivado da mutagénese por inserção do transposão, se poder compreender se este aumento de resistência esteve associado a elementos que já contribuem para o resistoma intrínseco de S. maltophilia, ou se a interferência com outras regiões do genoma resultou no aumento de resistência. Este aumento de resistência poderá ter um grande impacto num contexto médico, dado que pode ser transportado na transição entre o ambiente natural-nosocomial. Em ambientes nosocomiais, S. maltophilia também está exposta a elevados níveis de antibióticos, pelo que a influência de um bottleneck forte (2X CIM) foi avaliada. No entanto, nas condições aplicadas, nem a presença deste forte bottleneck nem o seu momento parecem ter afectado a resistência antimicrobiana das populações expostas a carbenicilina que foram capazes de lhe sobreviver. Esta capacidade de sobrevivência à exposição a elevados níveis de carbenicilina, em oposição aos restantes antibióticos, poder-se-á dever à expressão induzida ou constitutiva das β-lactamases L1 e L2 presentes no genoma de S. maltophilia, que são determinantes na sua resistência intrínseca a β-lactâmicos, como a carbenicilina. De acordo com o conceito de pré-condicionamento por hormese, a exposição a concentrações subinibitórias de antibióticos pode resultar nas populações microbianas serem capazes de melhor suportar exposições subsequentes a concentrações elevadas. Os resultados obtidos neste trabalho mostram que a exposição a concentrações estimulantes antes de um bottleneck (1X CIM) conduz a um aumento de resistência, em comparação com a ausência desta exposição. Logo, as populações inicialmente expostas às concentrações estimulantes suportaram melhor o bottleneck. Foi o caso das populações expostas a norfloxacina, que apresentam um aumento de resistência, tanto a norfloxacina como a cloranfenicol. A evolução desta resistência cruzada pode estar associada a bombas de efluxo de resistência a multidrogas (MDR), como SmeABC e SmeDEF, presentes no genoma de S. maltophilia, pois os mutantes de bombas de efluxo estão normalmente associados a um fenótipo de MDR a diferentes classes de antibióticos. De facto, já se demonstrou em S. maltophilia que mutantes de MDR seleccionados com norfloxacina apresentam geralmente resistência a norfloxacina e cloranfenicol. Dado que mutações resultantes de um único passo podem produzir um fenótipo de MDR, significa que genótipos presentes na população original da biblioteca de mutantes podem ter-se propagado durante a evolução sob concentrações estimulantes. Isto é relevante, por ser particularmente devido a fenótipos de MDR atribuídos a mecanismos de efluxo que as infecções causadas por S. maltophilia são difíceis de eliminar. De acordo com o conceito de pós-condicionamento por hormese, a presença de concentrações subinibitórias pode conferir um efeito benéfico às populações microbianas após exposição a elevadas concentrações de antibióticos. Neste trabalho, um aumento de resistência foi observado nas populações expostas a concentrações estimulantes somente após o bottleneck, em comparação com a ausência desta exposição. Tal foi o caso das populações expostas a norfloxacina, que mostram maior resistência a este antibiótico. Observou-se também uma recuperação de crescimento nas populações expostas a concentrações estimulantes de cloranfenicol após o bottleneck. Se os mecanismos que se especula estarem na base do pós-condicionamento por hormese estão correctos, as populações expostas a concentrações estimulantes após o bottleneck terão sofrido uma modulação ou activação extra de mecanismos de recuperação, que conduziram a um aumento de resistência e também a uma maior probabilidade de sobrevivência. No caso da norfloxacina e do cloranfenicol, tais mecanismos podem estar relacionados com mutações nos genes que codificam para subunidades da girase, como gyrA e gyrB, topoisomerase IV, como parC e parE, ou ainda com as bombas de efluxo de MDR. Neste contexto, é de notar que as populações expostas a concentrações estimulantes durante apenas 9 gerações antes do bottleneck, ou durante 11 gerações após o bottleneck, apresentam um aumento de resistência similar ao das populações expostas a concentrações estimulantes durante 157 gerações. Dado que um tal aumento de resistência desenvolveu-se em poucas gerações, isto significa que a resistência foi mais provavelmente seleccionada do que o resultado da acumulação de mutações. Reforça-se assim o papel das concentrações estimulantes, em adição ao do pré-condicionamento e pós-condicionamento por hormese. A futura whole-genome sequencing das amostras das populações microbianas possibilitará a compreensão dos mecanismos e a associação entre os mesmos, ao nível genómico, que permitem que um agente patogénico intrinsecamente resistente sofra um aumento de resistência quando exposto a concentrações estimulantes. Será então importante perceber se estes mecanismos estão envolvidos no resistoma intrínseco ou pertencem a outras regiões genómicas, e avaliar se os mecanismos subjacentes à evolução sob concentrações estimulantes e inibitórias são divergentes ou convergentes. Concluindo, os nossos resultados mostram que a exposição a concentrações estimulantes potencia a evolução de resistência antimicrobiana, em alguns casos cruzada, conferindo uma possível vantagem adaptativa. Na natureza, isto pode beneficiar o comportamento de bactérias susceptíveis e a sua selecção em ambientes de elevado uso de antibióticos. Sendo S. maltophilia um importante reservatório de determinantes de resistência em ambientes nosocomiais, estes resultados salientam a importância da hormese e, mais concretamente, das concentrações estimulantes, na potenciação da propagação de resistência, com particular relevância para a saúde humana.Antimicrobial subinhibitory concentrations are present in natural environments and body compartments during treatment. Although therapeutic high antimicrobial levels generate a bottleneck over microbial populations, subinhibitory concentrations can have beneficial effects on opportunistic pathogens, being antimicrobials a good example of hormesis. However, no relationship has yet been established between these stimulatory concentrations and selection of resistance. Could therefore stimulatory concentrations be an enhancer of resistance in intrinsically resistant opportunistic pathogens with environmental origin as Stenotrophomonas maltophilia? To understand the hormesis impact in antimicrobial resistance, S. maltophilia D457 strain and a derivative mini-Tn5-mutant library were used in evolution experiments performed until 157 generations, during 1296 hours, in presence of stimulatory and inhibitory concentrations previously determined. Observed stimulatory concentrations were 16, 160 and 64 fold lower than minimal inihibitory concentrations (MICs) of norfloxacin, chloramphenicol and carbenicillin, respectively. Continuous exposure to stimulatory concentrations lead to MICs 4 fold higher for norfloxacin, and 3 fold higher for chloramphenicol and carbenicillin, respectively, in comparison with evolution in antibiotic absence. Within 157 generations, this translated in MICs 8, 6 and 4 fold higher for these antimicrobials, in comparison with initial generation. Additionally, a resistance increase to both norfloxacin and chloramphenicol resulted from exposure to norfloxacin stimulatory concentrations prior to antimicrobial bottleneck. Higher resistance to norfloxacin and growth recovery resulted from exposure to norfloxacin and chloramphenicol stimulatory concentrations after bottleneck, respectively, in comparison with the absence of such exposure. Exposure to stimulatory concentrations for only 9 generations prior to bottleneck, or 11 generations after bottleneck, increased resistance to a level comparable to 157 generations exposure, whereby resistance was more likely selected than the result of accumulated mutations. Thus, our results show stimulatory concentrations to enhance the evolution of antimicrobial resistance. Being S. maltophilia an important reservoir of resistant determinants in nosocomial environments, this highlights the relevance of hormesis in resistance spread.Dias, RicardoTenreiro, Rogério Paulo de Andrade, 1955-Repositório da Universidade de LisboaSerra, Joana Soares Baptista, 1987-2013-01-17T14:46:10Z20122012-01-01T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/7525enginfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2023-11-08T15:50:48Zoai:repositorio.ul.pt:10451/7525Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T21:32:19.171266Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse
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