Construction of Ms6 derivative mutants as tools for interaction studies ith mycobacteria

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Pombo, Sofia Pires de Oliveira
Data de Publicação: 2014
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: eng
Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
Texto Completo: http://hdl.handle.net/10451/17840
Resumo: Tese de mestrado, Ciências Biofarmacêuticas, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia, 2015
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spelling Construction of Ms6 derivative mutants as tools for interaction studies ith mycobacteriaRecombineeringMycobacteriophage Ms6Ms6lysB::egfpMs6pin::gfpm2+MycobacteriaGFPTeses de mestrado - 2015Tese de mestrado, Ciências Biofarmacêuticas, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia, 2015Mycobacteriophage Ms6 is a temperate phage isolated in 1989 from a spontaneously induced culture of Mycobacterium smegmatis. Although several studies regarding lysis and integration have been published, the host range of Ms6 is not known. In this work we observed that incubation of this phage with fast- and slow-growing mycobacteria did not result in plaque or halos formation, as usually happens in infection plaque assay. However, an absence of clearing in a bacterial lawn does not mean that Ms6 in unable to infect the tested mycobacteria apart from its natural host, M. smegmatis. Taking this into consideration, our main goal was to construct Ms6 derivative mutants with reporter genes, and use them as tools to follow the mycobacteriophage replication inside other mycobacteria. Using the Bacteriophage Recombineering of Electroporated DNA (BRED) technique, we successfully constructed two Ms6 derivative reporter phages, Ms6lysB::egfp and Ms6pin::gfpm2+, by gene replacement. We successfully showed that their reporter proteins, improved green fluorescent proteins (GFP), are respectively expressed in Ms6 lytic and lysogenic life cycle, on M. smegmatis. Consequently, these new mutant phages are very important and useful tools to be used in future studies since they permit to follow a lytic or lysogenic cycle. With Ms6lysB::egfp and Ms6pin::gfpm2+, we expect to determine with more accuracy the ability of Ms6 to infect/replicate in other mycobacteria.O micobacteriófago Ms6 é um fago temperado, isolado em 1989 a partir de uma cultura de Mycobacterium smegmatis induzida espontaneamente. Apesar de vários estudos sobre o sistema de lise e integração terem já sido publicados, a gama de hospedeiros do Ms6 não é ainda conhecida. Neste trabalho verificou-se que a incubação deste fago com micobactérias quer de crescimento rápido quer de crescimento lento, não resultou na formação de placas fágicas nem de halos, tal como acontece num ensaio clássico de infecção em placa. No entanto, a ausência de placas fágicas não significa que Ms6 não tenha capacidade de infectar outras micobactérias para além de M. smegmatis, o seu hospedeiro natural. Tendo este facto em consideração, o principal objectivo deste trabalho foi construir fagos Ms6 mutantes com genes repórter, de modo a usá-los como ferramentas para testar a capacidade do Ms6 se replicar noutras micobactérias. Através da metodologia Bacteriophage Recombineering of Electroporated DNA (BRED), foi possível proceder a uma troca de genes do fago Ms6 por genes repórter e construir, com sucesso, dois fagos recombinantes designados Ms6lysB::egfp e Ms6pin::gfpm2+, capazes de produzir fluorescência quando infectam um hospedeiro sensível. Foi com sucesso que mostrámos que as proteínas verde fluorescentes modificadas (GFP), são expressas em M. smegmatis no ciclo lítico e lisogénico. Consequentemente, estes novos fagos mutantes constituem importantes ferramentas que poderão ser usados em estudos futuros, tendo em conta que permitem seguir o ciclo lítico e lisogénico. Esperamos assim, através dos fagos construídos Ms6lysB::egfp and Ms6pin::gfpm2+, conseguir determinar de uma forma mais precisa, a capacidade de Ms6 infectar/replicar-se em outras micobactérias.Pimentel, MadalenaRepositório da Universidade de LisboaPombo, Sofia Pires de Oliveira2015-04-01T11:21:43Z201520142015-01-01T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/17840TID:201987945enginfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2023-11-08T16:03:43Zoai:repositorio.ul.pt:10451/17840Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T21:37:35.052144Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse
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