Identification of NF-kB and MYC binding motifs in Herpesvirus ORF73
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| Data de Publicação: | 2011 |
| Tipo de documento: | Dissertação |
| Idioma: | eng |
| Título da fonte: | Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) |
| Texto Completo: | http://hdl.handle.net/10451/6509 |
Resumo: | Tese de mestrado. Biologia (Microbiologia Aplicada). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2011 |
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Identification of NF-kB and MYC binding motifs in Herpesvirus ORF73VirologiaHerpesvirusProteínasMutagéneseTeses de mestrado - 2011Tese de mestrado. Biologia (Microbiologia Aplicada). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2011O herpesvírus murídeo tipo 4, MuHV-4, é um gama-herpesvírus e, enquanto tal, estabelece infecções latentes em tecidos linfóides. Durante a infecção latente, o genoma de MuHV-4 persiste sob a forma de um epissoma no núcleo das células latentemente infectadas, e várias proteínas são expressas, entre as quais a proteína ORF73. Além do seu papel putativo na manutenção do epissoma viral, ORF73 modula os factores de transcrição celulares NF-kB e MYC, através do recrutamento das proteínas celulares Elonguina C e Culina 5, o que leva à formação do complexo de ligase de ubiquitina EC5SORF73 (ElonguinaC–Culina5–SOCS). O complexo EC5SORF73 interage com p65/RelA, um dos membros da família NF-kB, promovendo a sua poli-ubiquitinação e, consequentemente, a sua degradação pelo proteossoma. O complexo EC5SORF73 promove ainda a poli-ubiquitinação de MYC, o que resulta na estabilização desta proteína em vez da sua degradação, como se verifica para p65/RelA. Deste modo, ORF73 tem efeitos contrários sobre NF-kB e MYC, inibindo a actividade transcricional de NF-kB, mas activando a actividade transcricional de MYC. Recentemente, foi identificado um motivo na proteína ORF73, o motivo SOCS-box (resíduos 199–215), que é responsável pelo recrutamento das proteínas Elonguina C e Culina 5 e, consequentemente, pela formação do complexo EC5SORF73. A delecção funcional do motivo SOCS-box de ORF73, originando a proteína mutante ORF73–SOCS, impede a proteína viral de mediar tanto a poli-ubiquitinação de p65/RelA como a poli-ubiquitinação de MYC, comprometendo simultaneamente a sua capacidade de inibir a actividade transcricional de NF-kB e de activar a actividade transcricional de MYC, embora o mutante ORF73–SOCS mantenha intacta a capacidade de se ligar a ambos os factores celulares. Esta mutação suprime ainda a expansão do vírus MuHV-4 em células B e impede a infecção persistente in vivo. No entanto, como a mutação do motivo SOCS-box impede ORF73 de inibir NF-kB e de activar MYC em simultâneo, não é possível distinguir, em termos de fenótipo de infecção latente, o fenótipo que é devido à inibição de NF-kB e o fenótipo que resulta da activação de MYC. Além disso, a possibilidade de ORF73 mediar a poli-ubiquitinação de outros alvos celulares, ainda não identificados, não deve ser excluída. Portanto, é importante identificar regiões da proteína ORF73 cuja mutação permita segregar as suas funções modulatórias sobre os substratos celulares. A mutação dos motivos de ORF73 envolvidos na ligação a p65/RelA e a MYC constitui uma boa alternativa à mutação do motivo SOCS-box. Contudo, estes motivos de ligação ao substrato ainda não foram identificados, tendo sido apenas demonstrado que a região N-terminal de ORF73 (resíduos 1–140) é indispensável para a interacção de ORF73 com p65/RelA e MYC. A identificação dos motivos de ligação ao substrato na proteína ORF73 será importante para, em futuras experiências, construir vírus recombinantes que sejam incapazes de interagir e, consequentemente, de modular a actividade transcricional de NF-kB e de MYC, em separado. Deste modo, será possível distinguir os efeitos da inibição de NF-kB dos efeitos da activação de MYC sobre o fenótipo de MuHV-4, durante a infecção latente. O principal objectivo deste projecto foi a identificação de resíduos de aminoácidos específicos na proteína ORF73 necessários para a sua ligação a MYC ou a p65/RelA. Para tal, quinze proteínas ORF73 mutantes foram construídas, através de mutagénese por scanning de alanina na porção N-terminal de ORF73. Esta técnica consiste na substituição dos resíduos-alvo por resíduos de alanina, os quais permitem eliminar as cadeias laterais para além do carbono β, sem alterar a conformação da cadeia principal e sem impor efeitos electrostáticos extremos. A interacção dos mutantes de ORF73 com MYC e p65/RelA foi depois testada em experiências de co-imunoprecipitação. Os mutantes que interagiram fracamente com estas proteínas celulares foram sujeitos a ensaios funcionais, de modo a confirmar a diminuição da sua capacidade de modular MYC ou NF-kB. Deste modo, realizaram-se ensaios de gene repórter para testar se a perda de ligação de ORF73 a MYC ou a p65/RelA resultou na abolição da sua acção modulatória sobre a actividade transcricional destes factores celulares, e ainda ensaios de poli-ubiquitinação para investigar se essa perda de ligação se traduziu na perda da actividade de ligase de ubiquitina de ORF73. A capacidade destes mutantes para recrutarem os componentes do complexo EC5SORF73 também foi avaliada, através de experiências de co-imunoprecipitação com as proteínas Elonguina C e Culina 5. As experiências de co-imunoprecipitação com MYC ou p65/RelA e os mutantes de ORF73 que foram construídos permitiram identificar dois mutantes com uma capacidade comprometida para interagirem com estes factores celulares. O mutante ORF73141KKY143, com os resíduos 141KKY143 substituídos por alaninas, demonstrou uma severa diminuição na sua capacidade de interagir com MYC e p65/RelA, sugerindo que os resíduos 141KKY143 são importantes para a ligação de ORF73 a MYC e a p65/RelA. Por outro lado, o mutante ORF73138PLP140, com os resíduos 138PLP140 substituídos por alaninas, revelou uma diminuição parcial da sua capacidade de interagir com MYC, tendo permanecido intacta a sua capacidade de interagir com p65/RelA, o que indica que os resíduos 138PLP140 têm um papel na ligação de ORF73 a MYC, mas não na ligação a p65/RelA. Contudo, os mutantes ORF73141KKY143 e ORF73138PLP140 comportaram-se da mesma forma nos ensaios de gene repórter, sendo incapazes de activar a actividade transcricional de MYC e apresentando uma diminuição parcial do seu efeito inibitório sobre NF-kB, o que indica que tanto a mutação dos resíduos 141KKY143 como a mutação dos resíduos 138PLP140 afectam a acção modulatória de ORF73 sobre MYC e sobre NF-kB. Os resultados dos ensaios de poli-ubiquitinação mostraram estar de acordo com as observações dos ensaios de gene repórter, uma vez que ambos os mutantes foram incapazes de promover a poli-ubiquitinação de MYC e de p65/RelA, reforçando a ideia de que os resíduos 141KKY143 e 138PLP140 são importantes para a modulação de MYC e de NF-kB pela proteína ORF73. De seguida, a capacidade dos mutantes ORF73141KKY143 e ORF73138PLP140 para recrutarem a Elonguina C e a Culina 5, componentes do complexo EC5SORF73, foi avaliada através de experiências de co-imunoprecipitação. Ambos os mutantes recrutaram a Culina 5, mas foram incapazes de recrutar a Elonguina C, comprometendo assim a formação do complexo EC5SORF73 e, consequentemente, suprimindo a função de ligase de ubiquitina de ORF73. O facto de os mutantes ORF73141KKY143 e ORF73138PLP140 não conseguirem recrutar a Elonguina C, embora não tivessem mutações no motivo SOCS-box, sugere que as mutações introduzidas nos resíduos 141KKY143 e 138PLP140 tiveram um impacto severo na estrutura tridimensional de ORF73, possivelmente afectando outras funções da proteína viral, como o seu papel putativo na manutenção do epissoma. Este trabalho demonstrou ainda que a actividade de ligase de ubiquitina dos mutantes ORF73141KKY143 e ORF73138PLP140 estava comprometida, à semelhança do que se verificou com o mutante ORF73–SOCS, acima referido. Deste modo, não será possível clarificar, através da utilização destes mutantes em estudos in vivo, a contribuição independente da activação de MYC e da inibição de NF-kB pela proteína viral ORF73, durante a infecção latente de MuHV-4. Portanto, é necessário desenvolver outras estratégias para identificar os motivos de ligação de ORF73 a MYC e a p65/RelA, de modo a tornar possível a construção de mutantes de ORF73 que sejam incapazes de modular cada uma destas proteínas celulares separadamente. A resolução da estrutura tridimensional de ORF73, através de técnicas de cristalografia, pode dar um importante contributo para estes estudos.Murid herpesvirus-4 (MuHV-4) establishes latent infections in lymphoid tissues. During latency, ORF73 protein is expressed. ORF73 modulates the cellular transcription factors NF-kB and MYC, by assembling an EC5SORF73 (ElonginC-Cullin5-SOCS) ubiquitin-ligase complex. EC5SORF73 interacts with NF-kB family member p65/RelA, promoting its poly-ubiquitination and subsequent proteasomal degradation. EC5SORF73 also mediates MYC poly-ubiquitination, but this promotes MYC stabilization. Thus, ORF73 inhibits NF-kB whereas it activates MYC transcriptional activity. SOCS-box motif in ORF73 recruits ElonginC and Cullin5, assembling EC5SORF73 complex. However, the motifs of ORF73 involved in binding to p65/RelA and MYC are unidentified. Identification of ORF73 substrate-binding motifs is important to segregate NF-kB inhibition effects from MYC activation effects in MuHV-4 phenotype, during latency. The aim of this project was to identify specific amino acid residues, within N-terminus of ORF73, required for binding to MYC and p65/RelA. To this end, fifteen ORF73 mutants were generated by alanine-scanning mutagenesis, and tested on their ability to interact with those cellular substrates. ORF73141KKY143 mutant showed impaired ability to interact with MYC and p65/RelA, while ORF73138PLP140 mutant exhibited partially impaired ability to interact with MYC and intact ability to interact with p65/RelA. ORF73141KKY143 and ORF73138PLP140 mutants were unable to activate MYC transcriptional activity, had partially impaired inhibitory effect upon NF-kB, and were unable to promote MYC and p65/RelA poly-ubiquitination. Both mutants recruited Cullin5, but were unable to recruit ElonginC, thereby compromising the assembly of EC5SORF73 complex and consequently preventing ORF73 to function as an ubiquitin-ligase. This suggested that mutations at 141KKY143 and 138PLP140 residues had severe consequences in ORF73 three dimensional structure, possibly affecting several of its functions. Altogether, this work showed that ORF73141KKY143 and ORF73138PLP140 mutants are not useful to study the biological role of ORF73 modulatory function towards MYC and NF-kB. Hence, other strategies must be developed to identify MYC and p65/RelA binding motifs in ORF73.Simas, João PedroCaeiro, Filomena, 1950-Repositório da Universidade de LisboaCerqueira, Sofia Isabel Arriaga Mimoso, 1988-2012-06-11T17:41:08Z20112011-01-01T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/6509enginfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2023-11-08T15:49:01Zoai:repositorio.ul.pt:10451/6509Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T21:31:35.994367Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse |
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