Expression of recombinant human proteins involved in drug metabolism

• Autor(a) principal: Prazeres, João Miguel Pinto dos
• Data de Publicação: 2021
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: eng
• Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
• Texto Completo: http://hdl.handle.net/10400.26/36783
• topic: Citocromo P450; Glucuronosiltransferase; Citocromo P450 oxidorredutase; Subclonagem; Expressão proteica; Cytochrome P450; Glucuronosyltransferase; Cytochrome P450 oxidoreductase; Subcloning; Protein expression

Ao longo dos anos, a expressão heteróloga de proteínas recombinantes tem sido um campo muito estudado na biotecnologia, com diversas aplicações laboratoriais e industriais, desde a produção de proteínas para estudos de estrutura e função até à produção industrial, em larga escala, de proteínas como a insulina, que são utilizadas como agentes terapêuticos. A expressão heteróloga de proteínas está intrinsecamente ligada à tecnologia de DNA recombinante, que, ao permitir a manipulação dos genes envolvidos nos processos de expressão proteica, permite a obtenção de praticamente qualquer proteína desejada em quantidades apreciáveis. O objectivo deste trabalho foi o estabelecimento de estirpes bacterianas capazes de expressar proteínas humanas envolvidas no metabolismo de fármacos, de modo a possibilitar o seu posterior uso em modelos in vitro de metabolismo de fármacos. Recorrendo à sub-clonagem de cDNA, procurou-se clonar duas isoformas do citocromo P450 (CYP2C8 e CYP3A4), a NADPH:citocromo P450 oxidorreductase (POR), e a UDP-glucuronosiltransferase 2B7 (UGT2B7).Enquanto que os CYP e a POR estão envolvidas no metabolismo de fase I de muitos fármacos, bem como outros xenobióticos e compostos endógenos, catalisando a introdução de grupos polares de modo a facilitar a sua posterior metabolização, a UGT2B7 actua a nível da fase II, catalisando a inserção de grupos glucuronosilo nos fármacos, facilitando a sua excreção. Para realizar estas subclonagens foram aplicadas técnicas de clonagem tradicional usando amplificação de genes por PCR e sucessivas digestões enzimáticas, fazendo a ligação dos inserts em vetores de expressão com o auxílio de ligases. Em algumas das proteínas (CYP2C8, CYP3A4, e POR) foi aplicada também uma técnica de clonagem independente de ligação enzimática, recorrendo ao uso de primers e reações de PCR para amplificar os inserts de interesse e ligar estes a vetores específicos para este tipo de procedimento. Foram obtidos clones prontos a expressar em E. coli C43(DE3) das proteínas POR e UGT2B7 e clones da CYP2C8 e CYP3A4 em E.coli DH5α. As proteínas POR e UGT2B7 foram expressas concluindo que a proteína UGT2B7 pode ser obtida purificando o sobrenadante da lise celular das células expressas com uma coluna de permuta iónica eluída com um buffer com 25 mM de imidazole. Não foi possível obter a proteína POR através do mesmo método