EXPRESSÃO HETERÓLOGA DE ANTIGÉNIOS DO VÍRUS ZIKA EM ESCHERICHIA COLI

• Autor(a) principal: Caseiro, Catarina Sofia Fino
• Data de Publicação: 2017
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
• Texto Completo: http://hdl.handle.net/10362/34359
• topic: Vírus Zika; proteína da cápside; domínio NS3hel; Escherichia coli; sistema pET; Domínio/Área Científica::Engenharia e Tecnologia::Outras Engenharias e Tecnologias

O vírus Zika (ZIKV) é um arbovírus que pertence ao género Flavivirus da família Flaviviridae. Atualmente surge como um agente patogénico humano altamente relevante, não só pela possibilidade que demonstrou de se dispersar rapidamente, e de forma global, como pela sua associação ao desenvolvimento de uma série de malformações congénitas (incluindo microcefalia) e a síndrome de Guillain-Barré. Contudo, ainda pouco se conhece sobre a biologia do ZIKV, sendo para tal necessário o desenvolvimento de ferramentas básicas, nomeadamente, proteínas virais recombinantes ou anticorpos específicos, que permitam a utilização de uma grande variedade de protocolos experimentais. Neste estudo realizou-se a otimização da produção/purificação de antigénios virais de ZIKV em E. coli, nomeadamente, da proteína estrutural da cápside (C) e da região C-terminal da proteína NS3, à qual está associada atividade enzimática de RNAhel (NS3hel). Para tal, as sequências virais de genótipo selvagem e versões sintéticas com codões otimizados foram clonadas no vetor pET-29a, de modo a possibilitar a sua expressão, em E. coli, como proteínas de fusão com caudas de hexa-histidina (His6) na extremidade C-terminal. A expressão proteica heteróloga foi avaliada, quer em termos quantitativos, quer na solubilidade dos produtos obtidos. A identidade das proteínas C (≈ 13kDa) e NS3hel (≈ 15kDa) fundidas com caudas de His6 (C-His6 e NS3hel-His6, respetivamente) foi verificada através da sua purificação, em condições desnaturantes, por cromatografia de afinidade (em micro-escala) usando colunas com iões níquel imobilizados, e por western blot, utilizando anticorpos monoclonais anti-His6. As proteínas C-His6 e NS3hel-His6 foram, igualmente, sujeitas a purificação em condições nativas. Contudo, nestas condições, para além das proteínas em causa foi observada uma quantidade considerável de proteínas contaminantes. Ainda assim fica como prova de conceito o sucesso do processo de purificação em condições nativas.