Caracterização cinética e estrutural do sintase do óxido nítrico de Leishmania infantum

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Sabino, Fábio Mira Rocha
Data de Publicação: 2012
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: por
Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
Texto Completo: http://hdl.handle.net/10451/9353
Resumo: Tese de mestrado em Bioquímica, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2012
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spelling Caracterização cinética e estrutural do sintase do óxido nítrico de Leishmania infantumLeishmanioseLeishmania infantumÓxido nítricoSintase do óxido nítricoPromastigotaAmastigotaHemeTetrahidrobiopterinaTeses de mestrado - 2012Tese de mestrado em Bioquímica, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2012A leishmaniose é uma doença que ameaça cerca de 350 milhões de pessoas a nível mundial. O tipo mais grave da doença é a leishmaniose visceral, causada pelo parasita Leishmania infantum, com incidência na bacia do Mediterrâneo e América latina. Não existem ainda vacinas humanas nem tratamentos eficazes para a leishmaniose, o controlo desta doença é insuficiente e a área afectada pelo parasita tem aumentado. Consequentemente, a identificação de novos alvos terapêuticos eficazes assume uma elevada importância. Este projecto teve como principal objectivo caracterizar o sintase do óxido nítrico (NOS) de Leishmania infantum a nível estrutural, funcional e cinético ao longo do ciclo de vida do parasita, e o seu potencial como alvo terapêutico dada a relevância deste enzima em processos celulares vitais. Demonstrou-se pela primeira vez a presença de um NOS constitutivo dependente do cálcio activo nos diferentes estadios do ciclo de vida de Leishmania infantum. Foi descoberto que a sua actividade é regulada pelo cofactor tetrahidrobiopterina (BH4). Apesar da expressão do NOS não variar entre promastigotas e amastigotas, observou-se que a actividade do enzima é mais elevada em promastigotas em fase exponencial de crescimento do que em promastigotas em estado estacionário e amastigotas, evidenciando assim que o NO endógeno desempenha um importante papel importante na infectividade dos parasitas. Após otimização das condições de produção de NOS recombinante, elucidou-se pela primeira vez a estrutura quaternária do NOS de um tripanosomatídeo. O NOS de Leishmania infantum é um homotetrâmero enquanto os NOS de mamíferossão homodímeros. Observou-se ainda que o enzima do parasita não necessita de cofactores para formação da estrutura quaternária, sendo no entanto estabilizado pela ligação do heme e do BH4. Este enzima é destabilizado termicamente e por exposição ao NO, similarmente ao enzima de mamíferos. As diferenças estruturais e de sequência entre o NOS do parasita e as isoformas de mamíferos sugerem que este enzima seja um potencial alvo terapêutico em tripanosomatideos.Leishmaniasis is a disease that threatens 350 million people worldwide. The most serious type of the disease is the visceral leishmaniasis, caused by Leishmania infantum in the Mediterranean sea and Latin America. There are no human vaccines nor efficient treatment methods for the disease, the control of the infected animals is inefficient, and the area affected by the parasite is expanding. Therefore, the discovery of new therapeutic targets is extremely important. Our aim was to characterize kinetic, functional and structurally the nitric oxide synthase (NOS) from Leishmania infantum, during the parasite’s life cicle, accessing the potential of the NOS as a therapeutic target, due to its great importance for the cell. We showed for the first time the existence of a calcium-dependent constitutive NOS, which is active during the different stages of Leishmania infantum’s life cycle. This enzyme´s activity is regulated by the cofactor BH4, and its expression does not change between promastigotes and amastigotes. However, we showed that its activity is higher in exponential growth phase promastigotes than in stationary phase promastigotes and amastigotes. This way, it was shown that endogenous NO is important for parasite’s infectivity. After optimization of the recombinant enzyme production, we unveiled for the first time the quaternary structure of a NOS from a trypanosomatid. The NOS from Leishmania infantum is homotetrameric, while the mammalian NOS are homodimers. It was also observed that the parasite’s NOS does not need the presence of cofactors for the assembly of the quaternary structure. However, it is stabilized by the ligation of the heme group and tetrahydrobiopterin (BH4), and destabilized by high temperature and NO, similarly to the mammalian enzymes. The differences regarding the structure and sequence of the parasite’s and mammalian NOS, point this enzyme as a potential therapeutic target in trypanosomatids.Silva, Marta SousaCordeiro, Carlos, 1966-Repositório da Universidade de LisboaSabino, Fábio Mira Rocha2013-10-14T14:16:53Z20122012-01-01T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/9353porinfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2023-11-08T15:53:40Zoai:repositorio.ul.pt:10451/9353Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T21:33:35.551492Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse
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