Regulation of the mechanism of interference with Quorum sensing in Escherichia coli
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| Data de Publicação: | 2011 |
| Tipo de documento: | Dissertação |
| Idioma: | eng |
| Título da fonte: | Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) |
| Texto Completo: | http://hdl.handle.net/10451/6464 |
Resumo: | Tese de mestrado. Biologia (Microbiologia Aplicada). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2011 |
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Regulation of the mechanism of interference with Quorum sensing in Escherichia coliBiologia molecularExpressão génicaEnzimasEscherichia coliTeses de mestrado - 2011Tese de mestrado. Biologia (Microbiologia Aplicada). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2011Quorum sensing is a cell-to-cell signaling mechanism in which bacteria collectively control gene expression and therefore synchronize behaviors only productive at a high population density. The autoinducer-2 (AI-2) signal is produced by many bacteria and enables inter-species communication. In Escherichia coli, AI-2 is synthesized and secreted, accumulating in the extracellular medium. AI-2 concentration rises as bacteria divide and decreases rapidly in early stationary phase partially due to the expression of an ATP-binding cassette transporter, named Lsr (for LuxS-regulated) and encoded by the lsrACDB operon, which imports AI-2, removing it from the environment. Recent work showed that the phosphoenolpyruvate-dependent phosphotransferase system (PTS) plays an important role in the regulatory network of the Lsr transporter. Specifically, mutants in the ptsI gene, encoding for Enzyme I (EI) of the PTS, do not internalize extracellular AI-2 and do not activate the lsr operon. The present work showed that phosphorylation of EI is important for enabling the recovery of the defect of the ptsI mutation in AI-2 internalization but most likely not to phosphorylate AI-2 since LsrK kinase is required for AI-2 processing. In this study a genetic screen was performed to determine the molecular mechanism of the regulation of AI-2 internalization via EI by identifying suppressors of the ptsI mutant that can incorporate AI-2. A library of single-gene deletions of all non-essential genes in Escherichia coli in a ptsI deletion background strain carrying a lsr-lacZ promoter fusion was generated and screened for mutants with lsr-lacZ expression higher than the parent strain. Suppressors of the ptsI mutant were identified and the most interesting mutants are currently being analyzed to understand their role. The Lsr regulation was also studied using a new tool: green fluorescent protein (gfp) reporter fusions. These were compared with the commonly used promoter-lacZ fusions and their benefits and drawbacks were accessed. Understanding how the Lsr transport is dependent on the PTS, can reveal the molecular mechanism through which information about the physiological state of bacteria and regulation of AI-2 signal uptake is integrated.A detecção de quórum é um mecanismo de sinalização entre células, no qual as bactérias colectivamente controlam a expressão de genes e desta forma sincronizam comportamentos que apenas são eficientes a uma elevada densidade populacional. Este processo é caracterizado pela produção, pela secreção e pela detecção de pequenas moléculas de sinalização denominadas autoindutores. A concentração extracelular destes indutores encontra-se directamente relacionada com o número de indivíduos na população. Um desses indutores denomina-se autoindutor-2 (AI-2) que é um sinal produzido por muitas bactérias e constitui a primeira molécula a ser identificada que promove a comunicação célula-a-célula entre diferentes espécies bacterianas. Possibilita a comunicação inter-espécies, regulando vários fenótipos como a bioluminescência e a formação de biofilmes. Nas bactérias Salmonella Typhimurium e Escherichia coli, o AI-2 é sintetizado e secretado, acumulando-se no meio extracelular e a sua concentração aumenta à medida que as bactérias se vão dividindo. A actividade extracelular do AI-2 é máxima durante a fase exponencial tardia do crescimento bacteriano e decresce rapidamente durante a entrada na fase estacionária. Esta rápida internalização do AI-2 deve-se à expressão de um transportador do tipo ABC (do inglês “ATP-binding cassette”), denominado sistema de transporte Lsr (de LuxS-regulated) e que é responsável pela incorporação daquele sinal, possibilitando a sua fosforilação e processamento no interior da célula bacteriana. Este transportador é codificado pelo operão lsrACDB. Este sistema, o transportador Lsr, apresenta dois importantes reguladores: o LsrR, que é o repressor transcricional do operão lsr e a LsrK, que é a cinase que fosforila o AI-2 que é incorporado, a AI-2-fosfato (AI-2-P). Esta molécula activada liga-se ao regulador LsrR e a repressão por si mediada é removida, permitindo a transcrição do operão lsr e a formação do sistema de transporte Lsr. Estes reguladores são codificados pelos genes lsrR e lsrK, respectivamente, localizados imediatamente a montante do operão lsr e divergentemente transcritos na direcção oposta. O modelo actual para a incorporação do AI-2 assume a premissa que a produção do transportador Lsr se encontra reprimida pelo LsrR para evitar a expressão prematura do mecanismo de incorporação do AI-2, permitindo a acumulação de AI-2 no meio extracelular. Assim, se o LsrR se encontra a reprimir o operão lsr, não existe transcrição do transportador Lsr e supostamente não há internalização de AI-2. Contudo, na transição para a fase estacionária, a internalização do AI-2 inicia-se e para começar este processo, a fosforilação do AI-2 intracelular é necessária para inactivar a repressão mediada pelo LsrR. Assim, isto só seria possível se existisse um outro transportador de baixa afinidade que fosse capaz de incorporar o AI-2. O AI-2 seria posteriormente fosforilado e iria desencadear o sistema, permitindo a indução da expressão do transportador Lsr e que iria rapidamente incorporar o AI-2 presente no meio extracelular. Estudos recentemente efectuados demonstraram que a enzima I (EI) do Sistema das Fosfotransferases dependente do fosfoenolpiruvato (PTS) desempenha um papel importante na rede regulatória do transportador Lsr. Concretamente, foi observado que mutantes no gene ptsI, que codifica a EI, não internalizam o AI-2, nem activa a transcrição do operão lsr. Este facto, envolvendo o PTS na incorporação do AI-2, enquadra-se perfeitamente na observação de que mutantes no transportador Lsr apresentam uma incorporação lenta do AI-2 e que esta não é abolida. Uma vez que o AI-2 não se difunde passivamente através da membrana, um transportador desconhecido é capaz de importar este sinal. De acordo com isto e com o que foi observado no mutante ptsI, é plausível que o PTS, um importante sistema envolvido na incorporação de hidratos de carbono e na sua regulação, possa estar envolvido na internalização do AI-2 ou na regulação deste processo. De facto, foi igualmente demonstrado que a incapacidade do mutante ptsI para internalizar o AI-2 se deve, efectivamente, à incapacidade do AI-2 para entrar na célula. Apesar disto, o mecanismo dependente do PTS, que permite a incorporação de AI-2, é ainda desconhecido. Neste trabalho a importância da actividade fosfotransferase da EI para a incorporação do AI-2 e para a activação do operão lsr foi determinada. O mutante ptsI foi complementado usando um plasmídio induzido por IPTG e que continha um gene mutante do ptsI que codifica uma EI que não pode ser fosforilada (EIH189A), uma vez que se encontrava mutada no local de fosforilação e, apesar disso, a internalização de AI-2 não se verificou. Por outro lado, quando um alelo selvagem do gene ptsI é fornecido, a capacidade para incorporar AI-2 e a activação do operão lsr são repostas. Os resultados indicam que uma EI funcional, com um local de fosforilação preservado, é necessário para a incorporação de AI-2 e para a transcrição do operão lsr. Assim, a internalização do AI-2 podia ser efectuada por uma das 20 permeases PTS, específicas para cada hidrato de carbono ou por uma permease que não pertence à família PTS mas que é regulada por componentes do PTS, onde a EI e a sua actividade de fosfotransferase desempenharia um papel crucial neste processo. Neste estudo foi efectuado um rastreio genético para determinar o mecanismo molecular envolvido na regulação da internalização de AI-2 via EI, através da identificação de supressores da mutação ptsI, capazes de incorporar AI-2. Para isto, foi gerada uma biblioteca de delecções únicas de todos os genes não essenciais de Escherichia coli, num mutante no gene ptsI, que possuía uma fusão lsr-lacZ e procuraram-se mutantes duplos com uma expressão da fusão lsr-lacZ maior do que a estirpe parental. Este rastreio genético provou ser bem sucedido na identificação de supressores do mutante ptsI e neste momento os mutantes mais interessantes estão as ser estudados para compreender o seu papel na interacção entre o Sistema das Fosfotransferases e o sistema Lsr. Os genes que foram definidos como candidatos positivos no rastreio genético podem ser classificados em várias classes: genes codificando componentes do PTS ou reguladores do PTS; genes que codificam transportadores não PTS, como simportes, antiportes e transportadores ABC; genes codificando reguladores de transcrição que se ligam ao DNA; metiltransferases; genes com função desconhecida e genes com outras funções. Para além do rastreio genético, neste trabalho de investigação, outro instrumento foi implementado para o estudo da regulação do operão lsr, em vez das fusões com o gene lacZ, normalmente usadas, e dos ensaios de actividade da enzima β-galactosidase. Diferentes fusões repórter com o gene da proteína verde fluorescente foram construídas para avaliar a expressão do operão em diferentes estirpes e para as comparar com as fusões anteriores. O objectivo principal foi a implementação de novos métodos de estudo do operão lsr e a sua regulação em Escherichia coli. Em conjunto, os resultados obtidos neste trabalho de investigação mostram que o gene lsrK é transcrito juntamente com o gene lsrR pelo promotor lsrR e encontra-se sujeito à sua regulação. Como este promotor é mais forte do que o promotor do operão lsr, é menos reprimido pelo LsrR e transcrito a baixos níveis, mesmo na ausência do AI-2. Esta transcrição basal do promotor lsrR e desta forma dos genes lsrR e lsrK, antes da expressão do sistema de transporte Lsr, possibilita a presença do repressor da transcrição para evitar a indução prematura do sistema; e permite que a cinase LsrK fosforile o AI-2 que é primeiro internalizado pelo transporte dependente do sistema PTS, produzindo AI-2-P que se liga ao repressor LsrR, removendo a repressão por si mediada e promovendo a indução da expressão do transportador Lsr que rapidamente incorporará o AI-2 do meio extracellular. A compreensão do mecanismo de como o sistema de transporte Lsr se encontra dependente do PTS, pode revelar o mecanismo molecular através do qual a informação referente ao estado fisiológico das bactérias e a regulação da incorporação do AI-2 podem ser integradas.Xavier, KarinaSantos, MárioRepositório da Universidade de LisboaCorreia, Paulo José Braz Correia, 1984-2012-06-05T13:26:41Z20112011-01-01T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/6464enginfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2023-11-08T15:48:57Zoai:repositorio.ul.pt:10451/6464Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T21:31:34.219303Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse |
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