Optimization of the liposomal system of DODAB:MO: development of a vaccine against systemic infections caused by Candida albicans

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Dias, Marisol de Gouveia
Data de Publicação: 2019
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: eng
Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
Texto Completo: https://hdl.handle.net/1822/65194
Resumo: Dissertação de mestrado em Biofísica e Bionanossistemas
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spelling Optimization of the liposomal system of DODAB:MO: development of a vaccine against systemic infections caused by Candida albicansOtimização do sistema lipossomal DODAB:MO: desenvolvimento de uma vacina contra infeções sistémicas causadas pela Candida albicansCiências Naturais::Outras Ciências NaturaisDissertação de mestrado em Biofísica e BionanossistemasLiposomes have been the hallmark of lipid-based nanoparticles for site-specific delivery of drugs and pharmaceuticals. Previous studies have indicated that cationic liposomes are efficient liposomal delivery systems for vaccine antigens compared with other liposome systems. Indeed, it has been previously showed that cationic liposomes prepared with DODAB:MO (1:2) loaded with Candida albicans cell wall surface proteins are promising nanovehicles for vaccine strategy. C. albicans is an opportunistic yeast responsible for life threatening infections, mainly in immunocompromise patients. The use of a specific C. albicans one cell wall protein Cht3p, as an antigen could lead to the development of a more reproducible and stable formulation against these infections. So, the main objective of this work is to encapsulate this protein in the DODAB:MO (1:2) liposomes to protect the antigen and enhance its immunogenicity. In this work, the incorporation of recombinant Cht3p within the DODAB:MO (1:2) liposomes in different protein:lipid ratios (P/L) with two different encapsulation methods, incubation and hydration, was studied. These vesicles were evaluated in terms of size and surface charge of the liposomes, encapsulation efficiency, stability and in vitro cytotoxicity studies. The physicochemical properties of these liposomal nanoparticles (LNPs) were assessed at different P/L ratios in a range between 0.056 and 3.76. LNPs with P/L ratios higher than 0.11 destabilized and aggregate completely. So, the formulations with P/L ratios below 0.11 prepared by both encapsulation methods were studied, particularly ratios of P/L of 0.0056 and 0.0111. Liposomes prepared by the incubation method exhibited positively charged surfaces with ζ-potential values around +40 mV and mean sizes around 200 nm. While liposomes prepared by the hydration method were highly polydisperse (PDI values 0.6 to 0.9) with ζ-potentials values between +53 mV and +79 mV, and particle sizes with mean values between 708 nm and 1483 nm. No significant differences were observed in the encapsulation efficiency assays between the formulations prepared by both encapsulation methods, with values around 68 %. No clear differences were observed by extrusion procedure of LNPs prepared by the incubation method, but liposomes with Cht3p loaded by the hydration method showed a marked decrease in the particle size and a uniform size distribution. However, after two weeks of liposomal preparation, nanoparticles prepared by the hydration method started to destabilize. The long-term stability of the formulations was also tested by the lyophilization of the LNPs but showed the complete disruption of the all formulations. The in vitro cytotoxicity tests demonstrated that the Cht3p alone was cytotoxic to RAW 264.7 macrophage like cell line and when the Cht3p was encapsulated inside the liposomes the toxicity of the protein decreased. In conclusion, these experimental results indicate that the best encapsulation method for this protein is the incubation methodology. LNPs prepared by the incubation method with P/L ratios of 0.0056 and 0.011, using a final lipid concentration of 1 mM and 2 mM and 5 μg/mL of Cht3p, were more stable, presenting a particle size range between 88 nm and 173 nm, a monodisperse population (PDI values between 0.1 and 0.3) and ζ-potential values between +30 mV and +52 mV. These characteristics combined with their low cytotoxicity, makes this LNPs suitable to be used to be excellent candidates for use as delivery systems in an immunization strategy.Os lipossomas têm sido um marco importante de nanopartículas com base lipídica para a entrega específica de compostos e fármacos. Estudos anteriores demonstraram que os lipossomas catiónicos são sistemas de entrega de antigénios eficazes no desenvolvimento de vacinas, comparando com outros sistemas lipossomais. De facto, proteínas da superfície da parede celular da Candida albicans encapsuladas em lipossomas catiónicos de DODAB:MO (1:2) apresentaram um grande potencial para o desenvolvimento de uma nova vacina. C. albicans é uma levedura oportunista responsável por infeções potencialmente fatais, principalmente em pacientes imunocomprometidos. O uso de um antígeno específico da parede celular de C. albicans, a Cht3p, identificada anteriormente, poderá tornar a formulação mais reprodutível e estável, levando ao desenvolvimento de uma nova formulação contra estas infecções. Assim, o objetivo principal deste trabalho é encapsular este antígeno nos lipossomas DODAB:MO (1:2) para o proteger e aumentar o seu efeito imunogénico. Nesta investigação, estudou-se a incorporação da Cht3p recombinante com os lipossomas DODAB:MO (1:2) em diferentes rácios de proteína/lípido (P/L), preparados por dois métodos de encapsulação diferentes, o de incubação e o de hidratação. Estas vesículas foram avaliadas em termos de tamanho e carga superficial dos lipossomas, eficiência de encapsulação, estabilidade e citotoxicidade in vitro. As propriedades físico-químicas destas nanopartículas lipossomais (LNPs) foram avaliadas em diferentes rácios P/L que variaram entre 0,056 e 3,76. Os resultados indicaram que LNPs rácios superiores a 0,11 desestabilizaram e agregaram completamente. Assim, as formulações com rácios abaixo de 0,11 preparadas por ambos os métodos de encapsulação foram escolhidos, mais especificamente as LNPs com rácios P/L de 0,0056 e 0,0111. Os lipossomas preparados pelo método de incubação apresentaram superfícies carregadas positivamente com valores de potencial zeta de cerca de +40 mV e tamanhos médios das partículas com cerca de 200 nm. Segundo o método de hidratação, os LNPs apresentaram população mais heterogénea (PDI de 0,6 a 0,9), com valores de potenciais zeta entre +53 mV e +79 mV, e tamanhos das partículas entre 708 nm e 1483 nm. Não foram observadas diferenças significativas nos ensaios de eficiência de encapsulação entre as formulações preparadas por ambos os métodos de encapsulação, com valores em torno dos 68 %. Depois do processo de extrusão, não foram observadas alterações nas LNPs preparadas pelo método de incubação. Contudo, nas LNPs preparadas pelo método de hidratação, observou-se uma diminuição acentuada no tamanho das partículas e uma distribuição uniforme do tamanho. No entanto, após duas semanas da preparação lipossomal, as LNPs preparadas pelo método de hidratação começaram a desestabilizar. A estabilidade a longo prazo das LNPs foi também testada pelo processo de liofilização, verificando-se uma instabilidade de todas as formulações. Os testes de citotoxicidade demonstraram que a Cht3p administrada sozinha era mais citotóxica para a linha celular de macrófagos RAW 264.7 do que quando encapsulada no interior dos lipossomas. Em conclusão, estes resultados experimentais indicaram que o melhor método de encapsulação para a Cht3p é o de incubação. Neste método, as LNPs com rácios P/L de 0,0056 e 0,011, usando as concentrações lipídicas de 1 mM e 2 mM e com 5 μg/mL de Cht3p, apresentaram uma maior estabilidade, com um tamanho médio das partículas entre 88 nm e 173 nm, com uma população monodispersa (PDI de 0,1 a 0,3) e valores de potencial zeta entre +30 mV e +52 mV. Esta combinação de características, juntamente com uma menor citotoxicidade fazem destas LNPs excelentes candidatos para o uso de sistemas de entrega de antigénio numa estratégia de imunização.Sampaio, PaulaReal Oliveira, M. Elisabete C.D.Universidade do MinhoDias, Marisol de Gouveia20192019-01-01T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttps://hdl.handle.net/1822/65194eng202285723info:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2023-09-30T01:28:12Zoai:repositorium.sdum.uminho.pt:1822/65194Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T19:14:08.724338Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse
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