Modulation of the aggregation pathway of a model variant form of human phenylalanine hydroxylase: towards the development of a new class of pharmacological chaperones for the treatment of phenylketonuria
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| Data de Publicação: | 2020 |
| Tipo de documento: | Dissertação |
| Idioma: | eng |
| Título da fonte: | Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) |
| Texto Completo: | http://hdl.handle.net/10451/47666 |
Resumo: | Tese de mestrado, Biologia Molecular e Genética, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2020 |
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Modulation of the aggregation pathway of a model variant form of human phenylalanine hydroxylase: towards the development of a new class of pharmacological chaperones for the treatment of phenylketonuriaFenilcetonuriaDoencas RarasFenilalanina Hidroxilasep.G46SErros Hereditarios do MetabolismoChaperones FarmacologicosAgregacao proteicaMisfolding proteicoTeses de mestrado - 2020Departamento de Biologia VegetalTese de mestrado, Biologia Molecular e Genética, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2020Phenylketonuria (PKU; OMIM #261600) is an autosomal recessive disorder, caused mostly by missense mutation in the PAH gene, which encodes human phenylalanine hydroxylase (hPAH).Human PAH is a nonheme, homotetrameric, iron-containing enzyme, which catalyzes the conversion of LPhenylalanine (L-Phe) into L-Tyrosine, by para-hydroxylation of the aromatic side chain in the presence of the co-factor (6R)-L-erytro-5,6,7,8-tetrahydrobiopterin (BH4), non-hemic iron and molecular oxygen (O2). Presently, classical PKU patients must follow restricted diets in order to control L-Phe levels in the blood. Compliance is difficult and cognitive and social development impaired. PKU can be classified as a misfolding disease, since the majority of the PKU causing mutations result in misfolded hPAH variants which, in the cellular context, will form soluble aggregates targeted for degradation, leading to a loss-of-function phenotype. Therefore, pharmacological chaperone therapy imposes a viable alternative to PKU treatment. By stabilizing the variant protein, and avoiding its degradation, rescue of enzyme residual activity may be attained, improving patient’s quality of life by increasing dietary LPhe tolerance and alleviating some of the dietary restrictions imposed. Among the high number of PAH variants already identify, the p. G46S is considered an excellent model to the in vitro study of the hPAH aggregation process, as it presents a high tendency to selfassociate and form non-amyloid fibrils, when overexpressed in E.coli, and to be rapidly degraded in eukaryotic systems, representing the most severe form of Classical PKU phenotype. In the presence of maltose binding protein (MBP) added N-terminally to p.G46S, it is possible to obtain soluble metastable tetramers with a normal enzyme activity rate. Upon MBP tag cleavage with Factor Xa protease the hPAH p.G46S aggregates in a process efficiently followed in vitro. Our aim was to identify, among an in-house compound library, molecules able to modulate this behavior in vitro, and to characterize the underlying mechanism by studying the full-length (FL) and a truncated form of p.G46S representing the unstable N-terminal regulatory domain (N1-120) harboring the allosteric site. For this, the p.G46S forms were expressed in a prokaryotic system in fusion with the MBP tag and purified. The rate of self-association of the isolated FL tetramers and N1-120 dimers (variant and wild-type) were studied by real-time turbidimetry, upon cleavage of the MBP tag, in the presence and absence of studied molecules. Following in vitro studies, molecules with a positive impact on p.G46S aggregation were submitted to in cellullo studies to evaluate their influence on enzyme activity and stability. From the aggregation assays, five molecules had positive effects on the self-association pattern of the FL p.G46S, either by inhibiting aggregation or by delaying it. From those molecules, two (C4 and C14) also inhibited the wild-type and p.G46S RD1-120 aggregation, and one (C17) only impacted the aggregation of the wild-type RD1-120, suggesting that these molecules bind to the unstable N-terminal domain and particularly C4 and C14 will be interacting with helix a1 of the ACT domain, the main driver of p.G46S-RD1-120 instability while C17 is acting on a different region. In cellullo assays showed that C17 and C14 could improve enzyme activity when compared to p.G46S in the absence of compounds (control). Enzyme content in cell lysates, however, was at the same level as the p.G46S control, thus suggesting that these two compounds are promoting a stabilization of the enzymatic reaction, allowing it to present higher activity levels than it normally would have (activity chaperone), instead of acting as stabilizers of the protein helping it to avoid the cell protein control quality mechanisms (pharmacological chaperone). Although further studies were not carried out due to the restrictions and contingency plans applied by the Research institutions to respond to SARS-CoV-2_COVID-19 pandemics, here we present possible hit structures for the development of a new class of pharmacological/activity chaperones, specifically designed for the treatment of classical PKU.A fenilcetonuria (PKU; OMIM #261600) e uma doenca autossomica recessiva, causada na sua maioria por mutacoes missense no gene PAH, que codifica a fenilalanina hidroxilase humana (hPAH). A hPAH e uma enzima homotetramerica, que catalisa a conversao da L-fenilalanina (L-Phe) em Ltirosina (L-Tyr), por para-hidroxilacao da cadeia lateral aromatica. Para que esta reacao ocorra, e necessaria a presenca do seu co-factor natural (6R)-L-erytro-5,6,7,8-tetrahidrobiopterina (BH4), de ferro nao-hemico e oxigenio molecular (O2). As mutacoes missense no gene PAH originam na sua maioria a expressao de variantes de hPAH conformacionalmente alteradas (misfolded), no contexto celular, tem tendencia a formar agregados soluveis que rapidamente se tornam alvos das vias celulares de degradação proteica, levando a um fenotipo patologico de perda de funcao. A PKU e entao considerada uma doença conformacional, na qual o equilibrio normal dos estados folded« unfolded e alterado, deslocando-se preferencialmente para o estado unfolded. Consequentemente, as proteinas resultantes misfolded são reconhecidas, levando a que a maquinaria celular de controlo de qualidade e degradacao proteica atue no sentido de acelerar a degradacao de proteinas misfolded devido a sua instabilidade e tendencia para agregacao. Nos doentes PKU, quando nao tratados o mais rapidamente possivel apos diagnostico, a função alterada da hPAH variante resulta na acumulacao de L-Phe para niveis neurotoxicos, causando alteracoes neurologicas, convulsoes, atraso no desenvolvimento, problemas comportamentais, etc. O tratamento disponivel assenta basicamente em dietas restritivas e suplementos alimentares desde o diagnostico (preferencialmente dentro dos primeiros dias de vida) a fim de controlar os niveis de L-Phe em circulacao no sangue. Atualmente, as guidelines internacionais indicam que a restricao dietetica deve ser mantida durante a vida e que os niveis de L-Phe circulante devem ser mantidos abaixo de 600 μM (considerando niveis normais de circulacao no sangue ≈120 μM). A aquiescencia para com esta terapeutica e dificil, principalmente durante a adolescencia e nos adultos, e o desenvolvimento cognitivo e social sao prejudicados. Ao longo dos anos tem-se vindo a estudar diferentes terapeuticas alternativas, de forma a que seja possivel controlar os niveis de L-Phe circulantes e seja possivel um alivio nas restricoes dieteticas. A terapeutica baseada na administracao de chaperones propoem-se como uma alternativa viavel, uma vez que a PKU e atualmente reconhecida como uma doenca conformacional. Ao estabilizar a enzima misfolded e a sua degradacao iminente, permite-se que a enzima esteja presente e mantenha a sua atividade residual. Um leve aumento da capacidade de processamento da L-Phe poderá entao levar a um aumento da qualidade de vida do doente, aliviando algumas das restricoes dietéticas impostas. Ate a data, foram descritas tres abordagens diferentes para a terapia por chaperones: modulacao de chaperones moleculares a fim de resgatar proteinas com folding incorreto (reguladores de proteostase); chaperones quimicos e chaperones farmacologicos com o objetivo de estabilizar a proteina alterada, evitando-se a degradacao pelos sistemas de controlo de qualidade proteica. Entre as varias variantes causadoras de PKU, a p.G46S e considerada como um excelente modelo para o estudo in vitro do processo de agregacao da hPAH, uma vez que apresenta uma elevada tendencia para se autoassociar e formar fibrilhas nao amiloides, quando sobre-expressa em E.coli, e para ser rapidamente degradada em sistemas eucariotas, representando um fenotipo classico de PKU. Assim, e na presença da proteina de ligacao a maltose (maltose binding protein - MBP) adicionada a N-terminal da cadeia polipeptidica da p.G46S, e possivel obter tetrameros soluveis, metastaveis e com uma taxa de atividade enzimatica normal. Apos a clivagem da MBP com a protease Factor Xa (FXa), e entao possivel seguir in vitro e de forma eficiente o processo de agregacao da proteina hPAH p.G46S. Tendo em consideracao as caracteristicas descritas da p.G46S, o objetivo do presente estudo e o de identificar, de entre uma biblioteca de compostos desenhados e sintetizados pelo Grupo de Quimica Bioorganica do Instituto de Investigacao do Medicamento (iMed.ULisboa), moleculas capazes de modular o comportamento auto-associativo in vitro, e caracterizar o mecanismo subjacente atraves do estudo da proteina inteira (Full lenght; FL) e de uma forma truncada da p.G46S representando o domínio regulador instavel N-terminal (RD1-120) da hPAH e que contem o local de ligacao alosterico ao substrato L-Phe . Para tal, as formas de p.G46S (FL e RD1-120) foram expressas num sistema procariota como proteinas de fusao com a MBP e posteriormente purificadas. A taxa de auto-associacao dos tetrâmeros FL isolados e dos dimeros RD1-120 foram estudados por turbidimetria em tempo real, apos a clivagem da MBP, na presenca (100 μM) e ausencia das moleculas estudadas. Apos estudos in vitro, as moléculas com efeito inibidor na agregacao da p.G46S foram sujeitas a estudos in celullo com a finalidade de avaliar a sua influencia na atividade e estabilidade enzimatica na celula. Desta forma, células embrionicas do rim humano (human embryonic kidney cells), HEK293T, foram transfetadas com vetores de expressao eucariotas capazes de expressar a proteina p.G46S. Como controlo do ensaio celulas HEK293T foram tambem transfetadas com vetor de expressao contendo o gene normal da hPAH (wild type; WT). Para monitorizacao da estabilidade e variacao na tendencia de agregacao da proteína nas celulas eucariotas, foram realizados ensaios de imunocitoquimica. Adicionalmente, avaliou-se de que forma a funcao biologica celular da p.G46S seria afetada pela presenca dos compostos atraves da medicao da atividade enzimatica em lisados celulares. Dos ensaios de agregacao observou-se que cinco moleculas (C4, C10, C12, C14 e C17) tiveram efeitos positivos sobre o padrao de auto-associacao da forma FL da p.G46S, quer inibindo a agregacao, quer atrasando-a. Destas moleculas, duas (C4 e C14) atrasaram tambem a agregacao das formas truncadas representantes do RD (p.G46S e WT), enquanto uma (C17) apenas diminuia a agregacao da forma WT RD1-120, sugerindo que a interacao destas moleculas com a enzima ocorrera no dominio regulador N-terminal e que em particular as moléculas C4 e C14 deverao interagir com a helice a1 do dominio ACT promotora da instabilidade proteica. Estas cinco moleculas foram submetidas a estudos de imunocitoquimica, que, infelizmente, foram pouco conclusivos, devido a sobre-expressao tanto da proteina p.G46S como da WT, que impediu a discriminacao de agregados proteicos na celula. Desta forma, nao foi possivel obter resultados conclusivos acerca da capacidade de os compostos modularem a agregacao da proteina in cellullo. Para a avaliacao da modulacao da atividade biologica da proteina na celula pelos compostos em estudo (50 μM), realizaram-se ensaios na presenca de 0,5% DMSO e de 50 μM de C6 como controlos negativos. Como esperado, em ambos os ensaios a atividade enzimatica foi reduzida (» 15%), quando comparada com a hPAH WT. Estes resultados encontram-se em concordancia com os dados obtidos por analise de Western blot, sendo que os niveis intracelulares da proteina alvo se encontravam tambem reduzidos, quando comparados com a WT. Dos compostos que melhoravam a agregacao de p.G46S in vitro, tanto o C14 como o C17 mostraram ser capazes de melhorar a atividade da proteina variante, quando comparado com o ensaio controlo (p.G46S/0,5% DMSO). No entanto, para corroborar os pressupostos assumidos nas experiencias in vitro, ensaios adicionais deverao ser realizados, uma vez que se verificaram diferencas significativas entre os ensaios de atividade independentes, efetuados nas células HEK293T. Ao contrario do que seria de esperar, observou-se nos immunoblots, tanto para C14 como para C17, uma quantidade de proteina p.G46S tambem reduzida em comparacao com a hPAH WT, sugerindo que estes compostos poderao estar a estabilizar o processo enzimatico de modo a que esta tenha maior capacidade para realizar a sua funcao biologica (chaperone de atividade), ao inves de estabilizar a conformacao proteica, evitando a sua degradacao pela maquinaria de controlo de qualidade e degradacao proteica celular (chaperone farmacologico). Embora nao tenha sido possivel efetuar ensaios adicionais devido as restricoes impostas pelo plano de contingencia de combate a pandemia SARS-CoV-2_COVID-19, o presente estudo serviu como base para a identificacao de estruturas hit para o desenvolvimento de uma nova classe de chaperones farmacologicos ou chaperones de atividade direcionados para tratamento da PKU classica.Leandro, Ana Paula Costa dos Santos PeraltaFarinha, Carlos, 1973-Repositório da Universidade de LisboaBorges, Alice da Cruz Madeira2021-05-05T14:56:34Z202020202020-01-01T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/47666TID:202599493enginfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2023-11-08T16:50:45Zoai:repositorio.ul.pt:10451/47666Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T21:59:40.480618Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse |
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