Caracterização molecular do gene TEX11 em homens azoospérmicos

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Oliveira, Inês
Data de Publicação: 2018
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: por
Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
Texto Completo: http://hdl.handle.net/10400.18/6237
Resumo: Dissertação de mestrado em Biologia Humana e Ambiente, apresentada à Faculdade de Ciências da Universidade de Lisboa, 2018
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spelling Caracterização molecular do gene TEX11 em homens azoospérmicosInfertilidade MasculinaAzoospermiaCromossoma XTEX11Doenças GenéticasMale InfertilityAzoospermiaX ChromosomeTEX11Dissertação de mestrado em Biologia Humana e Ambiente, apresentada à Faculdade de Ciências da Universidade de Lisboa, 2018A investigação dos determinantes genéticos da fertilidade masculina nos últimos anos tem-se concentrado principalmente na análise do genoma humano por microarray e, mais recentemente, na sequenciação do exoma por sequenciação de nova geração (NGS). Apesar dos esforços realizados, não têm sido detetadas alterações genómicas específicas nem alterações pontuais patogénicas, com com elevada frequência , associadas à patologia em causa. Recentemente foi identificado o gene TEX11 localizado em Xq13.1, no âmbito do qual um número reduzido de estudos demonstra a sua importância para a fecundidade/gametogénese masculina. Esses estudos moleculares, realizados em amostras de homens inférteis, selecionados de acordo com parâmetros espermáticos, identificaram alterações com frequências que variam entre de 1 a 15%. Complementarmente, foi também demonstrado que certas alterações estão associadas a paragem da meiose no estágio de paquíteno, não tendo sido observados espermatídios redondos ou espermatozóides maduros nos túbulos seminíferos. A proteína TEX11 intervém na formação do complexo sinaptonémico e no estabelecimento dos pontos de quiasma no crossing-over cromossómico durante a meiose. Dado o conhecimento atual e a importância/função do gene em questão e porque não há estudos na população portuguesa sobre este gene, este projeto visou analisar a nível molecular o gene TEX11 em homens azoospérmicos e avaliar as suas consequências para a fertilidade masculina. Para este fim, a estratégia de análise molecular compreendeu: i) otimização da PCR simples para os 29 exões do gene em questão; ii) otimização de PCR múltiplas para os diversos exões do TEX11 visando a pesquisa de deleções; iii) pesquisa de alterações moleculares no gene em causa por sequenciação de nova geração (usando os produtos das PCR múltiplas), visando a identificação de alterações moleculares que possam afetar a função do gene/proteína; iv) avaliação das consequências funcionais de alterações detetadas através de análise in silico; v) estabelecimento de correlações genétipo/fenótipo; vi) pesquisa das alterações potencialmente patogénicas em homens férteis, detetadas no âmbito ponto iii); vii) confirmação destas alterações através da PCR simples e posterior sequenciação de Sanger. Através desta abordagem foi possível analisar 85 homens azoospérmicos, tendo sido também incluídas três amostras controlo, dois homens normozoospérmicos e uma mulher. Detetaram-se 27 alterações em sequências flanqueadoras dos exões ou nos próprios exões, as quais, após análise in silico e avaliação da sua frequência em bases de dados e publicações científicas (HGMD; 1000 Genomes), culminaram com a seleção de 5 alterações presumivelmente patogénicas/provavelmente patogénicas devido a poderem afetar o processamento (splicing) do respetivo mRNA. Embora três destas alterações possam perturbar o splicing, dada a sua frequência na população é possível que não estejam associadas a consequências funcionais graves correspondendo a polimorfismos. Obteve-se assim, uma taxa de deteção de alterações com potencial patogénico de 2,5% (2/79), sendo ambas alterações sinónimas: c.924C>T (p.Gly314=) e c.450C>T (p.Ala150=), que ocorrem com baixa frequência (<1%) na população. Futuramente, a realização de estudos complementares poderá comprovar a patogenicidade destas alterações, nomeadamente, estudos in vitro ou em modelos animais, a análise da segregação das mesmas em famílias com homens inférteis, estudos de imunohistoquímica em biópsias testiculares, a análise de uma amostra significativa de homens férteis (normozoospérmicos) e de um maior número de homens azoospérmicos.Research on the genetic determinants of male fertility in recent years has focused mainly on the analysis of the human genome by microarray and, more recently, on the sequencing of the exoma by Next Generation Sequencing (NGS). Despite the efforts made, no specific genomic alterations or pathogenic alterations have been detected with high frequency, associated with the pathology in question. Recently the TEX11 gene located in Xq13.1 has been identified, in which a small number of studies demonstrated its importance for male gametogenesis/fecundity. These molecular studies, performed on samples of infertile men, selected according to sperm parameters, identified alterations with frequencies ranging from 1 to 15%. In addition, it has also been shown that certain alterations are associated with the arrest of meiosis in the pachytene stage, with no round spermatozoa or mature spermatozoa being observed in the seminiferous tubules. The TEX11 protein intervenes in the formation of the synaptonemal complex and in the establishment of the chiasma points in the chromosomal crossing-over during meiosis. Given the current knowledge and importance/function of the gene in question and because there are no studies in the Portuguese population about this gene, this project aimed to analyse, at the molecular level the TEX11 gene in azoospermic men and evaluate its implications for male fertility. To reach this goal, the molecular strategy comprised: i) establishment of the PCR conditions for the 29 exons of this gene; ii) optimization of multiplex-PCRs for the TEX11 exons to search for deletions; iii) search for molecular alterations in this gene by next generation sequencing (using the multiplex PCR products), aiming to identify molecular alterations that may affect the gene/protein function; iv) assessment of the functional consequences of the alterations by in silico analysis; v) establishment of genotype/phenotype correlations; vi) search of the potential pathogenic alterations in fertile men detected on point iii); vii) confirmation of these alterations using PCR followed by Sanger sequencing. Through this approach it was possible to analyse 80 azoospermic men and 3 controls, two normozoospermic men and one woman. We detected 27 alterations/variants in introns or in exons t, which, after in silico analysis and evaluation of their frequency in scientific databases and publications (HGMD; 1000 genomes), culminated in the selection of 5 alterations that could be pathogenic/probably pathogenic affecting most probably the splicing. Although three of these changes may disrupt splicing, given their frequency in the population it is possible that they are not associated with severe functional consequences and most probably are polymorphisms. A rate of most probably pathogenic variants of 2,5% (2/80) was detected, both mutations being synonymous: c.924C>T (p.gly314=) and c.450C>T (p.Ala150=), occurring with low frequency (<1%) in the population. In the future, additional studies may prove the pathogenicity of these alterations, namely, in vitro or animal studies, segregation analysis in families with infertile men, immunohistochemical studies of testicular biopsies, analysis of a large number of fertile men (normozoospermic) and azoospermic men.Gonçalves, JoãoDias, DeodáliaRepositório Científico do Instituto Nacional de SaúdeOliveira, Inês2021-10-27T00:30:12Z2018-122018-12-01T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10400.18/6237porinfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2023-07-20T15:41:05Zoai:repositorio.insa.pt:10400.18/6237Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T18:40:30.992431Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse
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