Structural and functional diversity of the diazotrophic community in xeric ecosystems: response to nitrogen availability

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Almeida, Carolina Cristiano de
Data de Publicação: 2019
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: eng
Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
Texto Completo: http://hdl.handle.net/10451/41864
Resumo: Tese de mestrado, Microbiologia Aplicada, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2019
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spelling Structural and functional diversity of the diazotrophic community in xeric ecosystems: response to nitrogen availabilityFixação de NEcossistemas mediterrânicosFertilização com NMultifuncionalidade no ciclo do NDiversidade diazotróficaTeses de mestrado - 2019Departamento de Biologia VegetalTese de mestrado, Microbiologia Aplicada, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2019The effects of increased nitrogen (N) input in the ecosystems have brought concern for some time, however, the long-term consequences of this input to Mediterranean ecosystems are poorly studied. The Mediterranean ecosystem is considered a hotspot of biodiversity; the Mediterranean basin was considered one of the places in the world with most biodiversity. Taking in consideration that these ecosystems are regarded as environments under N limitation, changes in N availability will alter the relationships between the organisms. The research presented here was carried out on the Mediterranean basin and it is part of an ongoing study over the last 10 years, in which fields were fertilized with different quantities and forms of N. To understand the consequences of this fertilization, diazotrophic bacteria were isolated from rhizospheric soil of Ulex densus subjected to different N addition and characterized in terms of the structural and functional diversity of the communities, using this community as an ecological marker for comparing the different treatments. The methodology applied to understand the ecological consequences was the isolation of the rhizospheric bacteria in N free media and characterization of this collection of isolates, in terms of diversity (phenotypic and genotypic), morphophysiology (distribution of the isolates by different morphotypes), structure (identification of the genera associated with the treatments), functionality (ability to perform ammonification, nitrification and/or denitrification) and metabolic plasticity (ability to use different carbon sources). The N fixation of these isolates was confirmed by their growth in solid and liquid N free media and by isotopic characterization of the ratio of 15N over 14N; a search for the nifH gene was also performed. For this community there were no differences in diversity nor at the morphophysiological level between the different treatments. However, a higher number of isolates was detected in the treatments with higher NH4+ inputs (40A, and 80AN). The ability to perform N fixation was confirmed through multiple passages in solid and liquid N-free media and nifH gene was detected through PCR and dot-blot hybridization, though this was not possible for every representative isolate. Differences with genera associated with the form and quantity of N added to the soil were observed, with some genera only appearing in certain treatments. Every isolate presented more than one function in the N cycle and a decrease in nitrification together with an increase of denitrification was observed along with the increase of bioavailable N. Isolates belonging to genera detected exclusively in treatment 80AN presented higher N content and higher denitrification rates. The variation of the metabolic plasticity between the treatments increased with N fertilization, since the control treatment had the more consistent response for metabolic plasticity. The increase on the isolates number followed the same pattern as the proliferation of U. densus, showing that the potential for N fixation was not inhibited by NH4+ addition. The differences in genera associated with the treatments evidenced a change in the structure of the community. The results of multifunctionality showed a shift in the diazotrophic community, since nitrification and denitrification presented specificity towards different forms of fertilization. The higher variation of the metabolic plasticity associated with N fertilization can be related to changes in carbon source availability in the soil. From the work presented here and future work can arise a platform to direct alterations on the agriculture and ecological guidelines. These alterations are essential to protect this kind of ecosystem, which is extremely important due to the unique biodiversity associated with it.Há algum tempo que os efeitos do aumento de nitrogénio (N) introduzido nos ecossistemas leva a preocupação, no entanto, as consequências a longo prazo desta introdução nos ecossistemas mediterrânicos estão pouco estudadas. O ecossistema mediterrânico é considerado um hotspot de biodiversidade; a bacia mediterrânica é um dos locais com mais biodiversidade no mundo. Tendo em consideração que estes ecossistemas são considerados ambientes com limitações ao nível do N, as mudanças na disponibilidade de N vão alterar as relações entre os organismos. O estudo aqui apresentado foi levado a cabo na bacia mediterrânica e faz parte de um estudo que já começou há 10 anos e continua a ser efetuado, em que os talhões foram fertilizados com diferentes formas e quantidades de N. De forma a entender as consequências desta fertilização, foi isolada a comunidade de bactérias diazotróficas a partir de solo rizosférico de Ulex densus sujeito a diferentes adições de N e foi caracterizada a diversidade estrutural e funcional da comunidade. A comunidade diazotrófica foi utilizada como um marcador ecológico para a comparação entre os diferentes tratamentos. Os microrganismos que conseguem realizar a fixação de N, ou seja, a conversão de N2 em NH3, são chamados de diazotróficos. Esta conversão ocorre através da ação da enzima nitrogenase, e existem três tipos desta enzima que variam no cofator associado: Mo, Va ou Fe. A estrutura da comunidade diazotrófica não apresentou diferenças entre os tratamentos em termos de diversidade, no entanto o índice de diversidade genotípico apresentou um poder de discriminação maior que o índice de diversidade fenotípico entre os isolados e, portanto, é essencial complementar os resultados fenotípicos com o perfil genotípico obtido por PCR fingerprinting. Foi detetado um número mais elevado de isolados diazotróficos heterotróficos nos tratamentos com maior adição de NH4+ (40A e 80AN), estes são os mesmos tratamentos em que existe proliferação de Ulex densus, mostrando assim que o potencial para a fixação de N não foi inibido pela adição desta forma de N. Foram observadas diferenças entre os géneros identificados dependendo da forma e quantidade de N adicionado ao solo, mostrando mudanças na estrutura da comunidade. Para esta identificação foram escolhidos 40 representantes, sendo 10 de cada tratamento, e foram considerados uma boa representação da coleção de isolados por não apresentarem valores de semelhança superiores a 55%. A maioria dos géneros que foram identificados estão associados com a fixação de N ou pelo menos apresentam um espécie pertencente ao género que apresenta a capacidade de realizar fixação de N. A capacidade de realizar fixação de N foi confirmada através de múltiplas passagens por meio sem N quer na forma líquida quer na forma sólida e o gene nifH foi detetado através da técnica de PCR e por hibridação dot-blot. Apesar de os isolados representantes terem sido identificados como sendo pertencentes a géneros associados com a capacidade de realizar a fixação de N e os pares de primers escolhidos serem capazes de amplificar o gene nifH dos clusters onde estes géneros estão incluídos, não foi possível amplificar e/ou detetar o gene nifH da maioria dos isolados. Isto pode significar que o gene nifH destes isolados é diferente das sequências utilizadas para desenhar os primers. Até há pouco tempo, era comum associar determinados grupos de microrganismos a uma biotransformação especifica do ciclo do N. Contudo ultimamente tem sido exposto que a maioria dos isolados tem potencial para realizar diversas biotransformações de N, nomeadamente combinações de fixação de N, amonificação, nitrificação e desnitrificação. Isto representa um fator extremamente importante, uma vez que a multifuncionalidade é essencial para a adaptação dos microrganismos ao meio ambiente. Os isolados representantes de cada um dos tratamentos foram testados para diferentes processos do ciclo do N: amonificação, nitrificação e desnitrificação. Todos os isolados apresentaram mais do que uma função no ciclo do N. Pode ser observada uma mudança na multifuncionalidade da comunidade diazotrófica devido ao aumento da biodisponibilidade de N. De facto, a capacidade de realizar nitrificação foi encontrada mais frequentemente entre os isolados representantes da comunidade de tratamentos que recebem mais baixas quantidade de NH4+ (tratamento controlo e 40AN), o que está de concordo com o que foi reportado em estudos anteriores, em que o aumento da disponibilidade de NH4+ leva a uma inibição na nitrificação. Foi encontrada capacidade desnitrificante em todos os tratamentos, no entanto os isolados do tratamento 80AN (recebe mais nitrato) apresentaram taxas de desnitrificação mais elevadas. Taxas de desnitrificação mais elevadas podem ser relevantes como mecanismo de desintoxicação de nitrato, uma vez que elevadas concentrações de nitrato podem inibir a fixação de N. A alteração da multifuncionalidade microbiana associada com biotransformações de N está associada a mudanças na composição da comunidade diazotrófica, sendo corroborado pelas diferenças nos géneros identificados nos diferentes tratamentos. Com base nos resultados apresentados, é sugerido que o isolado identificado como pertencente ao género Pedobacter apresente uma sensibilidade para concentrações elevadas de N, e por isso pode ser possível que a ausência deste género possa estar associada a um aumento da disponibilidade de N. Por esta razão, este género pode ser um candidato a indicador biológico das alterações no ecossistema. Não foi possível associar a multifuncionalidade dos isolados com a plasticidade metabólica. No entanto, quando foram analisados dois géneros comuns a diferentes tratamentos - Pseudomonas e Stenotrophomonas - foi possível observar diferenças na resposta à adição de N. Os isolados identificados como Pseudomonas apresentaram uma resposta uniforme ao longo dos diferentes tratamentos, correspondendo a uma elevada plasticidade metabólica. Contudo, no caso dos isolados identificados como Stenotrophomonas o mesmo já não foi observado, pois a plasticidade metabólica aumenta com o aumento da disponibilidade de N. Isto pode dever-se à adaptação destes microrganismos ao aumento da disponibilidade de N ou os isolados podem pertencer a espécies distintas com diferente plasticidade metabólica. Apesar de ser possível identificar algumas diferenças entre os tratamentos em termos das propriedades funcionais da comunidade, estas diferenças não são tão evidentes como seria de esperar, de acordo com a literatura, e não corroboram completamente a teoria de que a comunidade diazotrófica devia ser afetada pela adição de N. Estas discrepâncias podem dever-se ao ecossistema que está a ser estudado, o ecossistema mediterrânico, que apresenta características distintas dos outros ecossistemas estudados em trabalhos semelhantes, e por isso os efeitos da adição de N podem não ser os mesmos. Por último, a comunidade escolhida neste trabalho como indicador das respostas do ecossistema, a comunidade diazotrófica, pode não ter sido a escolha certa, uma vez que não se verificam grandes alterações estruturais com o aumento da biodisponibilidade de N. A comunidade estudada foi isolada a partir do solo rizosférico de Ulex densus que é uma espécie que prolifera nos tratamentos com maior disponibilidade de N. Desta forma a planta pode estar a contrabalançar os efeitos da adição de N levando a que não haja diferenças na comunidade diazotrófica entre os tratamentos. Pode ainda ser o facto de a comunidade rizosférica conseguir aguentar as pressões ecológicas e manter este grupo de microrganismos, uma vez que estes apresentam uma função importante que pode ser benéfica para a comunidade rizosférica quando em condições de N limitante. O trabalho apresentado neste estudo, e trabalho futuro que possa advir dele, pode criar uma plataforma para alterações nas políticas agrícolas e ambientais, que são necessárias para a preservação deste tipo de ecossistemas que apresentam uma biodiversidade única.Cruz, Cristina, 1964-Tenreiro, Rogério Paulo de Andrade, 1955-Repositório da Universidade de LisboaAlmeida, Carolina Cristiano de2020-02-17T15:21:31Z201920192019-01-01T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/41864TID:202482472enginfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2023-11-08T16:41:32Zoai:repositorio.ul.pt:10451/41864Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T21:55:03.899604Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse
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