Desenvolvimento de novos suportes cromatográficos para purificação do DNA plasmídeo

• Autor(a) principal: Ferreira, Soraia Nunes
• Data de Publicação: 2014
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
• Texto Completo: http://hdl.handle.net/10400.6/6098
• topic: Affinity Chromatography; L-Tyrosine; L-Tyrosine-L-Arginine; L-Tyrosine-L-Tyrosine; Plasmid Dna; Pvax1-Lacz; Spr; Std-Nmr; Domínio/Área Científica::Engenharia e Tecnologia:: Outras Engenharias e Tecnologias

Nos últimos anos, a aplicação de DNA plasmídeo (pDNA) em terapia génica ou vacinas de DNA tem-se revelado uma ferramenta com potencial aplicação no tratamento de inúmeras doenças. Uma vez que esta abordagem recorre a vetores não-virais, é mais segura em termos de ativação de oncogenes e apresenta uma diminuição de reações do sistema imunitário. Deste modo, a indústria farmacêutica procura obter pDNA em maiores quantidades e isento de contaminantes (RNA, DNA genómico, endotoxinas, proteínas). Uma técnica que permite purificar o pDNA é a cromatografia de afinidade (AC). Esta metodologia baseia-se em interações específicas entre ligandos e o pDNA, permitindo a eliminação de alguns passos de purificação. A utilização de aminoácidos como ligandos de afinidade revelou ser uma abordagem promissora para purificar ácidos nucleicos, pois baseia-se na bioespecificidade aminoácido-nucleótido. A L-histidina e a L-arginina permitiram isolar a isoforma superenrolada (sc) do pDNA, indicando a presença de interações específicas entre o pDNA e os aminoácidos. Neste trabalho são apresentados os resultados de três ligandos, a L-tirosina e os dipeptídeos L-tirosina-L-tirosina e L-tirosina-L-arginina. Os dipeptídeos foram sintetizados de acordo com o método clássico de síntese química, que envolve a proteção do grupo amina e do grupo carboxílico de cada aminoácido, e posterior formação da ligação peptídica e por fim desproteção usando TFA (ácido trifluoracético). De seguida, os ligandos foram imobilizados na Sepharose CL-6B através da ativação dos grupos epóxi com o reagente 1,4-butanediol diglicidil éter. O suporte foi caracterizado por HR-MAS (Ressonância Magnética de Alta Resolução de Ângulo Mágico) RMN. A técnica de STD-RMN (Diferença da Transferência de saturação por ressonância magnética nuclear) permitiu identificar os grupos preferenciais dos 5´-mononucleótidos que interagem com os suportes Sepharose-L-tirosina, Sepharose-Ltirosina- L-tirosina e Sepharose-L-tirosina-L-arginina. Utilizando a técnica de RPS (Ressonância Plasmónica de Superfície), foi analisada a afinidade de cada um dos ligandos em estudo em relação a cada uma das isoformas de pVAX1-LacZ a diferentes temperaturas (T=10°C e 25°C) e usando diferentes tampões (Tris-HCl 10 mM e Hepes ácido 10 mM). Desta forma, a utilização das técnicas STD-RMN e SPR permitiu fazer o screening das interações dos suportes-5’- mononucleótidos e determinar a afinidade do complexo ligando: pDNA, para futura aplicação em AC.