New strategies for antibody drug delivery

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Oliveira, Joana Rita Gomes
Data de Publicação: 2016
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: eng
Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
Texto Completo: http://hdl.handle.net/10451/28386
Resumo: Tese de mestrado, Ciências Biofarmacêuticas, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia, 2016
id RCAP_1ee31c491d1150e97fc8a8d677111f9b
oai_identifier_str oai:repositorio.ul.pt:10451/28386
network_acronym_str RCAP
network_name_str Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
repository_id_str 7160
spelling New strategies for antibody drug deliveryAntibody drug conjugate (ADC)Antibody engineeringCytotoxic drugsTumor microenvironmentCancerTeses de mestrado - 2016Ciências da SaúdeTese de mestrado, Ciências Biofarmacêuticas, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia, 2016Antibody drug conjugates (ADCs) are growing as a new class of biopharmaceuticals that combines the specificity of monoclonal antibodies to deliver cytotoxic drugs selectively to a target antigen. In addition, monoclonal antibodies have demonstrated to have a significant importance in cancer treatment in contrast to classic chemotherapy which demonstrates limited selectivity against cancer cells resulting in a loss of efficacy. ADCs combine these two classes of drugs with their complementing characteristics, creating a highly selective and cytotoxic therapy. Although ADCs have been under investigation for decades, with almost 120 total clinical trials, only two ADCs have been approved by FDA and EMA. The low cytotoxic drug potency and antigen selectively together with unstable linkers are the most frequent limitations identified in the ADC constructs. For this, understanding how each of the components of an ADC contributes to the efficacy and safety profile is essential to maximize clinical success. To this end, as data continue to emerge from the clinic, we will gain a better understanding of what changes are needed to improve the clinical activity of ADCs. Targeting the tumor microenvironment and include small antibody fragments are promising approaches for the development of future ADCs. To overcome all the limitations presented in the previous ADCs, in the present work we demonstrate a proof-of-concept for the development of a new strategy for antibody drug delivery. For this, we engineered two bispecific VHH heterodimers composed by an anti-methotrexate VHH and an anti-CXCR4 VHH. To enhance the specificity to the tumor microenvironment, in one of the constructs (anti-MTX M1-CXCR4) sequence encoding a MMP-9 cleavage site was introduced to facilitate the release of cytotoxic drug in the target cells. All constructions were successfully constructed, expressed and purify with high yields of purified soluble protein. For anti-MTX M1-CXCR4, ELISA demonstrated selective binding to methotrexate-serum albumin conjugate. Flow cytometry assay showed specific surface binding and internalization via CXCR4 receptor and an evident decrease in cell viability in the presence of recombinant proteins were assessed by MTT assay. Regarding anti-MTX M1-CXCR4, this protein induce cell death by a mechanism which is not completely understood. Preliminary assays showed that cell death is not dependent on the presence and release of MTX and induced toxicity in a concentration-dependent manner in which a decrease in toxicity is a result of loss of function. In addition, cell death assays suggest that cells suffer necrotic death. In conclusion, findings presented in this dissertation suggest that antibody-based constructs are promising therapeutic strategies to delivery cytotoxic drugs specifically to tumor microenvironment.Os conjugados de anticorpo-fármaco (do inglês, antibody-drug conjugates (ADCs)) têm surgido como uma nova classe de biofármacos que combinam a especificidade dos anticorpos monoclonais com a entrega específica de fármacos citotóxicos. Os anticorpos monoclonais desempenham um papel importante no tratamento de várias doenças, como o cancro e doenças autoimunes tornando-se assim, primeira linha de tratamento em algumas destas doenças. Além disso, a quimioterapia, que constitui a terapêutica clássica no caso de doenças oncológicas, caracteriza-se pela falta de selectividade contra as células cancerígenas levando a que estes fármacos apresentem uma janela terapêutica estreita, resultando na falta de eficácia. Os ADCs surgem como uma alternativa que combina as propriedades destas duas classes de fármacos, o que os torna altamente específicos e eficazes no tratamento de doenças oncológicas. Apesar dos ADCs terem sido alvo de investigação durante as ultimas décadas, com aproximadamente 120 moléculas em ensaios clínicos, apenas dois ADCs foram aprovados pela agência norte-americana de produtos alimentares e de medicamentos (FDA) e pela agência europeia do medicamento (EMA). As limitações surgem sobretudo na falta de potência dos fármacos, na instabilidade da ligação do anticorpo ao fármaco e a baixa selectividade do anticorpo para o antigénio alvo. Como os ADCs são constituídos por um anticorpo monoclonal, um fármaco citotóxico e um linker que une estes dois componentes é necessário perceber a contribuição de cada um dos componentes para aumentar a eficácia desta nova abordagem terapêutica. Com este propósito, à medida que se avança na investigação clínica, vai-se ganhando uma melhor compreensão sobre quais as mudanças necessárias a fazer para aumentar o sucesso dos ADCs. Bloquear antigénios com expressão aumentada no microambiente tumoral 0e substitutir os anticorpos monoclonais por pequenos derivados de anticorpos recombinantes têm surgido como estratégias promissoras para o desenvolvimento de novos ADCs. De forma a ultrapassar as limitações apresentadas pelos ADCs desenvolvidos anteriormente, o objectivo proposto para este projeto científico foi o desenvolvimento e prova de conceito de uma nova estratégia de ADCs. Para isso, foi construído um heterodímero biespecífico composto por dois anticorpos recombinantes (VHH, designado também como nanobody): um deles foi desenvolvido contra o metotrexato (MTX) e o outro contra receptor de quimiocinas CXCR4. O MTX é um potente agente citotóxico usado no tratamento de várias doenças oncológicas e autoimunes. No entanto, o tratamento prolongado com MTX induz o aumento de efeitos adversos e de mecanismos resistência ao fármaco por parte das células cancerígenas. Por isso, o desenvolvimento de novos sistemas de entrega destas moléculas citotóxicas têm sido amplamente estudadas. Por sua vez, o receptor de quimiocinas CXCR4 é um receptor transmembranar que apresenta a sua expressão aumentada em vários tipos de tumores sendo por isso considerado um alvo promissor para o desenvolvimento de novas terapêuticas. Para validar a nossa estratégia, três VHH contra o MTX (anti-MTX VHH) foram sintetizados como monómeros. Em duas das construções foi ainda introduzida uma sequência de clivagem da MMP-9 (proteína da família das metaloproteinases da matriz) em dois locais diferentes na sequência do VHH de forma a facilitar a libertação do MTX para as células alvo. As três construções foram clonadas num vector de expressão bacteriano, expressas em E.Coli e purificadas posteriormente. Os resultados obtidos mostraram que apenas duas das construções, uma com o sitio de clivagem da MMP-9 e outra sem (anti-MTX M1 VHH e anti-MTX WT VHH, respectivamente), foram estavelmente produzidas em bactérias mantendo as propriedades naturais de ligação ao MTX. Depois destes resultados preliminares, os heterodímeros biespecíficos foram então construídos tendo sido testada a posição do anti-MTX VHH (tanto a N-terminal como a C-terminal) com o objectivo de escolher a construção mais estável e solúvel. Como feito anteriormente, as construções foram clonadas num vector de expressão bacteriano e purificadas. Com base nos rendimentos obtidos nas purificações, as construções com o anti-MTX VHH a N-terminal foram selecionadas para os ensaios seguintes (anti-MTX WT-CXCR4 e anti-MTX M1-CXCR4). Depois da expressão e purificação das proteínas recombinantes foi necessário confirmar que as propriedades de ligação ao MTX foram mantidas. Para isso, e uma vez que não é possível imobilizar o MTX a uma placa de ELISA foi necessário desenvolver uma estratégia em que o MTX foi acoplado à albumina (BSA-MTX) e usado como antigénio no ELISA. Os resultados demonstram que um dos heterodímeros biespecíficos (anti-MTX WT-CXCR4) e um dos monómeros (anti-MTX WT) ligam-se especificamente ao MTX. No entanto, nas construções em que o anti-MTX M1 está presente verifica-se um aumento de interações não específicas com a BSA, usada como controlo. Em paralelo, um ensaio funcional feito apenas com os monómeros (anti-MTX WT VHH e anti-MTX M1 VHH) mostrou que na presença de MMP-9, o anticorpo é clivado e o MTX é libertado. Uma vez que os heterodímeros são proteínas biespecíficas é necessário avaliar a especificidade dos dois domínios funcionais. Neste caso, e para avaliar a ligação ao CXCR4, foi realizado um ensaio de citometria de fluxo utilizando a linha celular Jurkat E6-1. Relativamente ao anti-MTX WT-CXCR4, os resultados sugerem que a proteína liga especificamente ao CXCR4 à superfície e é capaz de internalizar através deste receptor. Além disso, os resultados obtidos numa linha celular Jurkat CXCR4 negativa, evidenciam, mais uma vez, que a ligação e internalização desta proteína recombinantes é dependente do CXCR4. No entanto, os resultados relativos ao anti-MTX M1-CXCR4 demonstram que esta construção induz morte celular. Com o objectivo de tentar compreender o mecanismo pelo qual o anti-MTX M1-CXCR4 induz a morte celular, vários ensaios preliminares foram realizados. Os resultados sugerem que a morte celular não depende da presença e da libertação do MTX e que a toxicidade é dependente da concentração. Além disso, ensaios de morte celular sugerem que as células estão a morrer por um processo que induz necrose. Com base em todos os resultados promissores obtidos anteriormente foi realizado um ensaio de citotoxicidade in vitro (MTT) de forma a avaliar a eficiência deste novo sistema de entrega de citotóxicos através de anticorpos. Os resultados mostram uma evidente diminuição na percentagem de células vivas para todas as contruções. No entanto, o anti-MTX M1-CXCR4 é o que apresenta uma maior redução na viabilidade celular. Em paralelo, e uma vez que os fragmentos de anticorpos recombinantes exibem várias limitações farmacocinéticas, uma outra estratégia foi desenvolvida. Para isso, foi construída uma proteína biespecífica que contém um anticorpo monoclonal contra o receptor HER-2 (Trastuzumab, Herceptin®) acoplado ao anti-MTX VHH (anti-MTX WT e anti-MTX M1). Os resultados de ensaios de transfecção e Western Blot sugerem que as proteínas recombinantes foram construídas e expressas com sucesso na linha celular HEK293T. Como perspectivas futuras, é necessário realizar novos ensaios de forma a perceber qual o mecanismo que leva à morte celular na presença do anti-MTX M1-CXCR4. Além disso, os ensaios de citotoxicidade (MTT) terão que ser realizados com concentrações mais altas dos conjugados anticorpo-farmáco de forma a confirmar a eficácia in vitro destas construções. Além disso, é necessário desenvolver um método mais específico para a quantificação e purificação dos conjugados. Relativamente aos ensaios de ligação e internalização ao CXCR4, é necessário construir um heterodímero em que seja incluído um VHH irrelevante de forma a provar, por outra forma, que a ligação e internalização é dependente do receptor. Em conclusão, os resultados obtidos demonstram que os heterodímeros de VHH biespecíficos desenvolvidos neste trabalho podem ser usados como uma nova estratégia promissora para a entrega de citotóxicos através de anticorpos surgindo assim como uma nova abordagem de ADCs.Gonçalves, JoãoRepositório da Universidade de LisboaOliveira, Joana Rita Gomes2019-09-19T00:30:33Z2016-11-222016-09-192016-11-22T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/28386TID:201487241enginfo:eu-repo/semantics/embargoedAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2023-11-08T16:20:11Zoai:repositorio.ul.pt:10451/28386Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T21:44:40.108308Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse
dc.title.none.fl_str_mv New strategies for antibody drug delivery
title New strategies for antibody drug delivery
spellingShingle New strategies for antibody drug delivery
Oliveira, Joana Rita Gomes
Antibody drug conjugate (ADC)
Antibody engineering
Cytotoxic drugs
Tumor microenvironment
Cancer
Teses de mestrado - 2016
Ciências da Saúde
title_short New strategies for antibody drug delivery
title_full New strategies for antibody drug delivery
title_fullStr New strategies for antibody drug delivery
title_full_unstemmed New strategies for antibody drug delivery
title_sort New strategies for antibody drug delivery
author Oliveira, Joana Rita Gomes
author_facet Oliveira, Joana Rita Gomes
author_role author
dc.contributor.none.fl_str_mv Gonçalves, João
Repositório da Universidade de Lisboa
dc.contributor.author.fl_str_mv Oliveira, Joana Rita Gomes
dc.subject.por.fl_str_mv Antibody drug conjugate (ADC)
Antibody engineering
Cytotoxic drugs
Tumor microenvironment
Cancer
Teses de mestrado - 2016
Ciências da Saúde
topic Antibody drug conjugate (ADC)
Antibody engineering
Cytotoxic drugs
Tumor microenvironment
Cancer
Teses de mestrado - 2016
Ciências da Saúde
description Tese de mestrado, Ciências Biofarmacêuticas, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia, 2016
publishDate 2016
dc.date.none.fl_str_mv 2016-11-22
2016-09-19
2016-11-22T00:00:00Z
2019-09-19T00:30:33Z
dc.type.status.fl_str_mv info:eu-repo/semantics/publishedVersion
dc.type.driver.fl_str_mv info:eu-repo/semantics/masterThesis
format masterThesis
status_str publishedVersion
dc.identifier.uri.fl_str_mv http://hdl.handle.net/10451/28386
TID:201487241
url http://hdl.handle.net/10451/28386
identifier_str_mv TID:201487241
dc.language.iso.fl_str_mv eng
language eng
dc.rights.driver.fl_str_mv info:eu-repo/semantics/embargoedAccess
eu_rights_str_mv embargoedAccess
dc.format.none.fl_str_mv application/pdf
dc.source.none.fl_str_mv reponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informação
instacron:RCAAP
instname_str Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informação
instacron_str RCAAP
institution RCAAP
reponame_str Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
collection Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
repository.name.fl_str_mv Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informação
repository.mail.fl_str_mv
_version_ 1799134368035241984

Registros relacionados