Functional and metabolic characterization of antitumour macrophages
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| Data de Publicação: | 2021 |
| Tipo de documento: | Dissertação |
| Idioma: | eng |
| Título da fonte: | Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) |
| Texto Completo: | http://hdl.handle.net/10451/53971 |
Resumo: | Tese de mestrado, Oncobiologia, Universidade de Lisboa, Faculdade de Medicina, 2021 |
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Functional and metabolic characterization of antitumour macrophagesMicroambiente tumoralVigilância imunitáriaMacrófagosImunoterapia contra o cancroMetabolismoTeses de mestrado - 2021Domínio/Área Científica::Ciências MédicasTese de mestrado, Oncobiologia, Universidade de Lisboa, Faculdade de Medicina, 2021O microambiente tumoral é um ecossistema muito heterogéneo, constituído não apenas por células tumorais mas também por matriz extracelular, fibroblastos e ainda células do sistema imunitário, tanto da linhagem mieloide como da linfoide. Estas células do nosso sistema de defesa possuem a capacidade natural de vigiar e eliminar tumores em desenvolvimento, principalmente por meio das propriedades citotóxicas das células T. No entanto, as células imunológicas muitas vezes não conseguem controlar o crescimento desregulado dos tumores devido a mecanismos de evasão – por eles mesmos induzidos – que surgem e se desenvolvem ao longo da carcinogénese, prejudicando a imunidade antitumoral e comprometendo a sobrevivência do hospedeiro. Com efeito, à medida que o tumor se desenvolve, as próprias células malignas educam o estroma que as rodeia para superar os obstáculos da vigilância imunológica, tanto por meio de fatores solúveis imunossupressores, como por comunicações célula a célula inibidoras do sistema imunitário ou ainda através de competição metabólica por nutrientes. Estes factores, todos em conjunto, impedem a erradicação do cancro por meio do sistema imunitário. Entre os elementos do microambiente tumoral que são directa ou indirectamente modulados pelas células malignas, destacam-se as células mieloides por geralmente constituírem a população imunitária mais representativa dos infiltrados imunes e, mais ainda, pela plasticidade funcional que demonstram, podendo exercer funções tanto antitumorais como protumorais, de acordo com os estímulos que recebem nos tecidos em que se encontram. Com isto em mente, verificámos que tem sido dada uma atenção desproporcional entre as células mieloides que promovem o crescimento de tumores (protumorais) em relação às células que os tentam combater (antitumorais). Por isso, estamos convencidos de que mais esforços devem ser feitos para perceber como é que podemos aumentar a atividade protetora das células mieloides no contexto do cancro. O conhecimento dos mecanismos utilizados pelo nosso sistema de defesas sempre foi fundamental ao longo da história para o desenho de terapias eficientes, em qualquer contexto clínico. Assim, o conhecimento biológico e consequente manipulação terapêutica das células mieloides podem colaborar com as terapias existentes contra o cancro, por exemplo a quimio- e a imunoterapia, para melhorar os cuidados de saúde e a sobrevivência dos pacientes oncológicos. No sentido de estudar o potencial antitumoral das células mieloides, neste trabalho utilizámos um modelo ortotópico de células tumorais mamárias de ratinho (E0771) que nos permite estudar as actividades antitumorais das células mieloides in vivo. Tirando partido da capacidade inerente que estas células possuem de responder a agentes de maturação, como ligandos dos receptores Toll-like receptor (TLR) e moléculas co-estimuladoras, pudemos demonstrar nesta tese que a injecção intratumoral de um ligando do TLR3 (Poly I:C) em combinação com um agonista da molécula co-estimuladora CD40 (tratamento MCT) foi capaz de induzir remissão total dos tumores implantados, na esmagadora maioria dos ratinhos tratados. Demonstrando posteriormente que este tratamento combinatório não é prejudicial, em si mesmo, para as células tumorais, concluímos que o efeito alcançado dever-se-ia ao impacto do tratamento no microambiente tumoral. Com o objectivo de dissecar os mecanismos subjacentes ao efeito marcante que alcançámos com este tratamento e tendo em consideração a capacidade inerente que as células mieloides têm para responder ao mesmo, eliminámos os macrófagos selectivamente e reparámos que o tratamento perdeu a sua eficácia. Concluímos, assim, que o efeito terapêutico era dependente da ação dos macrófagos. Analisando de seguida os infiltrados imunitários após o tratamento, observámos que os macrófagos associados ao tumor (TAMs) sobre expressaram duas moléculas pro-inflamatórias com propriedades antitumorais conhecidas, a saber TNF e iNOS, por comparação com os ratinhos não tratados. Para estudar o papel que estas moléculas poderiam ter na resposta antitumoral mediada pelos macrófagos, utilizámos um sistema in vitro de macrófagos derivados da medula óssea de ratinhos. Após a diferenciação, tratámo-los com diferentes estímulos para podermos comparar o comportamento dos macrófagos estimulados com o MCT com macrófagos antitumorais (M1) e protumorais (M2a e M2c). Verificámos, em primeiro lugar, que os macrófagos MCT sobre expressaram igualmente TNF e iNOS, dando credibilidade à nossa metodologia. De seguida, observámos que o sobrenadante (SN) dos macrófagos MCT era capaz de induzir morte das células E0771, por semelhança com o SN dos M1 e por diferença com o SN dos M2a e M2c. Para perceber se este efeito se devia à produção de TNF, utilizámos o mesmo sistema em cima descrito com o suplemento de anticorpos monoclonais que bloqueavam a ação do TNF. No entanto, a presença do anticorpo não foi capaz de aumentar viabilidade celular das células E0771. Para estudar a importância desta molécula in vivo, injectámos os mesmos anticorpos bloqueadores do TNF concomitantemente com o tratamento MCT. Em sintonia com os resultados obtidos in vitro, não registámos qualquer diferença na eficácia do tratamento. Como abordagem alternativa, utilizámos clones das células E0771 resistentes à ação do TNF. Após a transplantação ortotópica destas células e da injecção do MCT, reparámos que o tratamento foi igualmente eficaz. Estes resultados, no seu conjunto, levaram-nos a concluir que o TNF não tem um papel importante enquanto mediador da resposta antitumoral dos macrófagos. Procurámos, então, perceber se a expressão de iNOS poderia ser responsável pelas propriedades antitumorais dos macrófagos estimulados com o MCT. Aproveitando ratinhos geneticamente modificados para não expressar iNOS (ratinhos iNOS-ko), diferenciámos macrófagos in vitro e tratámo-los como em cima está descrito. Interessantemente, observámos que na ausência da expressão de iNOS as propriedades antitumorais dos SN dos macrófagos MCT estavam significativamente reduzidas, sugerindo que o MCT é capaz de induzir a expressão de iNOS em macrófagos para mediar a sua resposta antitumoral. Impulsionados pela caracterização funcional dos macrófagos antitumorais MCT, e sabendo que o metabolismo celular pode ditar o resultado funcional das células imunes, investigámos os requisitos metabólicos dos macrófagos MCT. Para nossa surpresa, descobrimos que eles diferiam dos macrófagos M1, que eram marcadamente glicolíticos, e que, ao invés disso, exibiam uma dependência mitocondrial semelhante à dos macrófagos M2, perfil metabólico este que se pensa ser ajustado às características nutricionais do microambiente tumoral. Essa semelhança refletiu-se depois num conteúdo celular de ATP semelhante entre os macrófagos MCT e M2. Dadas estas semelhanças, perguntámo-nos quais seriam os substratos metabólicos que suportavam o metabolismo mitocondrial dos macrófagos MCT. Curiosamente, observámos que os macrófagos MCT eram capazes de captar glicose de forma semelhante aos M1 e que possuíam um conteúdo lipídico distinto dos M2. Juntando a evidência de que os macrófagos M1 tinham a maior capacidade de acidificar o meio de entre todos os macrófagos, concluímos que os macrófagos MCT não usam os lípidos como fonte de energia, como fazem os macrófagos M2, mas antes desviam o piruvato derivado da glicose para alimentar o TCA e o metabolismo mitocondrial. Para nossa surpresa, observámos que os macrófagos MCT apresentaram a menor massa mitocondrial e o menor potencial de membrana mitocondrial quando comparado com os outros fenótipos de macrófagos (M0, M1 e M2a). Futuros estudos mais detalhados permitir-nos-ão, por um lado, compreender a biologia das mitocôndrias dos macrófagos e, por outro lado, desvendar se e como é que as mitocôndrias orquestram as funções antitumorais de macrófagos MCT. Em conclusão, o trabalho aqui desenvolvido demonstra que o tratamento MCT induz macrófagos antitumorais que expressam iNOS e que apresentam um metabolismo marcadamente dependente da mitocôndria. Acreditamos que estes estudos promissores estabelecem as bases para o desenvolvimento de estratégias terapêuticas que abranjam a reprogramação funcional e metabólica dos TAMs, com vista à sua combinação com outras terapias contra o cancro.The tumour microenvironment (TME) is a heterogeneous ecosystem populated by myeloid and lymphoid immune cells that have the natural capacity to patrol and eliminate nascent tumours, mainly through the cytotoxic properties of T cells. However, immune cells often fail to control tumour growth due to escape mechanisms induced by tumour cells themselves that halt antitumour immunity and ultimately prevent tumour eradication. These include immunosuppressive soluble factors, deleterious cell to cell interactions and metabolic competition for nutrients. Among the cellular participants of the TME modulated by tumour cells, the myeloid compartment has a prominent role as they can exert antitumoural or protumoural functions according to the surrounding environmental cues. With this is mind, we believe there has been a disproportionate attention on protumour over antitumour myeloid cell functions, and that more efforts should be put on understanding how to enhance the protective activity of myeloid cells in the context of cancer. In this thesis, we took advantage of myeloid cell inherent capacity to respond to maturing agents, such as TLR ligands and co-stimulatory agonists, to study their antitumour potential. Using the E0771 TNBC orthotopic mouse model, we observed that the injection of TLR3 ligand plus an anti-CD40 agonistic mAb (Myeloid-Cell Treatment; MCT hereafter) was able to induce tumour regression in the vast majority of treated mice. The prevention of this regression by clodronate-encapsulated liposomes suggested a key antitumour role for macrophages. Furthermore, MCT-activated tumour-associated macrophages (TAMs) overexpressed TNF and iNOS, which are known tumoricidal molecules, when compared to the respective controls. Taking advantage of in vitro bone marrow-derived macrophages (BMDMs) to dissect the contributions of each molecule, we first observed that the supernatant derived from MCT-stimulated BMDMs increased E0771 cell death, demonstrating their antitumour properties. BMDMs also presented increased expression of TNF and iNOS. However, in vivo and in vitro studies with anti-TNF blocking antibodies suggested a neglectable role of TNF in MCT-induced antitumour immunity. Together with in vivo experiments with an TNF-resistant E0771 clone, we excluded TNF as the soluble mediator of antitumour MCT-TAMs in this model. Finally, iNOS expression in MCT-BMDMs was found critical for the decreased tumour cell viability in vitro, thus suggesting MCT programmes TAMs with iNOS-dependent antitumour properties. Given that cellular metabolism can dictate the functional outcome of immune cells, we then investigated the metabolic requirements of MCT BMDMs. To our surprise, we found that MCT BMDMs differed from pro-inflammatory/antitumoural in vitro-differentiated M1 macrophages, which were markedly glycolytic, as they instead displayed a mitochondrial dependency that was similar to anti inflammatory/protumoural M2 macrophages, which reflected on comparable ATP contents in MCT and M2 BMDMs. These data contradicted previous reports that linked glucose oxidation with antitumour functions, and led us to investigate the metabolic intermediates that supported MCT-BMDMs mitochondrial metabolism. We observed MCT-BMDMs had similar glucose uptake compared to M1, and distinct lipid content when compared to M2 BMDMs. Collectively with the evidence that M1 BMDMs had the highest capacity to acidify the medium, we concluded that MCT BMDMs presumably divert glucose-derived pyruvate to feed into the TCA and support mitochondrial metabolism. To our surprise, MCT BMDMs displayed the lower mitochondrial mass and potential when compared to all other BMDMs phenotypes (M0, M1 and M2a). Further studies will be needed, on one hand, to understand BMDMs mitochondrial biology and, on the other hand, to unravel if and how mitochondria orchestrate antitumour functions of MCT-stimulated macrophages. In conclusion, our data reveal that MCT effectively induces iNOS-expressing antitumour macrophages that feature a mitochondrial metabolism, presumably fitted to the nutrient availability of the TME. We believe this thesis lays the groundwork for the design of therapeutic strategies that encompass functional and metabolic reprogramming of TAMs. Harnessing the myeloid compartment therapeutically could synergize with standard and emerging anticancer therapies to improve oncologic patient healthcare and survival.Serre, KarineRepositório da Universidade de LisboaMota, Afonso Maria Douwens da Costa Teixeira da2022-07-26T16:34:10Z2021-05-142021-05-14T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/53971TID:202727610enginfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2023-11-08T17:00:17Zoai:repositorio.ul.pt:10451/53971Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T22:04:57.767805Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse |
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