Mechanisms of protein dysfunction in aminoacyl-tRNA synthetase related to neurological diseases

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Ferreira, Diogo Miguel Fernandes Meireles
Data de Publicação: 2021
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: eng
Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
Texto Completo: http://hdl.handle.net/10451/53544
Resumo: Tese de Mestrado, Bioquímica, 2022, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências
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spelling Mechanisms of protein dysfunction in aminoacyl-tRNA synthetase related to neurological diseasesExpressão heteróloga por bactériasBioquímica de proteínasEARS2 humanaRARS2 humanaDoenças Mitocondriais (MD)Teses de mestrado - 2022Domínio/Área Científica::Ciências Naturais::Ciências QuímicasTese de Mestrado, Bioquímica, 2022, Universidade de Lisboa, Faculdade de CiênciasMitochondrial diseases (MD) are heterogeneous human diseases and one of the most common group of inherited metabolic diseases, with an estimated incidence of 1:5000 individuals. The number of reported mutations associated with this type of diseases has been increasing for the past years, however, due to their complexity, they are still very challenging at clinic and therapeutic level. Therefore, it is important to understand the molecular mechanism underlying these diseases, to develop successful diagnosis and therapies. Recently, several reports identified mutations on genes coding for mitochondrial aminoacyl-tRNA synthetases (mt-aaRSs), as a cause of different MDs. These enzymes are nuclear encoded and perform their function inside mitochondria. They catalyze the specific attachment of the corresponding amino acid to the respective transfer RNA (tRNA), thus ensuring the fidelity of protein translation, especially of the complexes from the respiratory chain. These complexes are encoded by mitochondrial DNA (mt DNA) and their synthesis occurs inside the mitochondria, therefore, the action of mt-aaRSs is extremely important for their formation. As such, disease-associated variants of mt-aaRSs may impair the correct synthesis of the respiratory chain complexes, which ultimately lead to mitochondrial dysfunction. The main goal of the project is to clarify the molecular mechanism of MD diseases associated to mt-aaRSs disease variants. Specifically, here we focus on two mt-aaRSs: human mitochondrial glutamyl tRNA synthetase (hEARS2) and human mitochondrial arginyl-tRNA synthetase (hRARS2), whose variants have been reported to be associated to leukodystrophies. Our aim is to establish for the first-time protocols for heterologous expression and purification of these two proteins, and structurally characterize them. We successfully established a protocol for expression and purification of hEARS2. For this protein we were able to obtain a significant amount of pure enzyme, which allow us to perform protein structural characterization. Our results showed that heterologous expressed hEARS2 presents an α/β fold, and in the native state tryptophan residues are exposed to the solvent. Stability studies, following loss of secondary structure, showed that hEARS2 thermal unfolding has a cooperative transition with an apparent melting temperature (Tm app) of ~ 68 ºC. Interestingly, monitoring changes at the tertiary structure level, hEARS2 presented a lower melting temperature, with a Tm app of 51 ºC. Moreover, in the presence of increasing concentrations of its substrate, glutamate, protein alters its native conformation, however we did not observe major changes in melting temperature. Regarding hRARS2 we established a protocol for protein expression and purification, however the protocol for protein purification must be further optimized. Nevertheless, we were able to perform preliminary analysis of protein structure and stability. As purified hRARS2 presented an α/β fold with a Tm app of ~ 61 ºC, that value decreased when tryptophan emission was being followed. Overall, these data represent an important breakthrough on the heterologous production of two human mt-aaRS proteins. Moreover, these data provide an important basis for future studies on disease variants, that will permit to elucidate how mutations lead to disease phenotypes.As doenças mitocondriais (MD) representam um grupo de doenças humanas inatas heterogéneas, com elevada heterogeneidade clínica. São consideradas das mais comuns entre as doenças metabólicas com origem genética, com uma prevalência de cerca de 1:5000 indivíduos. Nos últimos anos, o número de estudos nos quais foram identificadas mutações associadas com este tipo de doenças tem vindo a aumentar, no entanto, devido à complexidade das MD, é difícil estabelecer uma correlação entre o genótipo e o fenótipo, e assim estabelecer terapêuticas. Desta forma, torna-se importante perceber o mecanismo molecular associado às MD, e assim, desenvolver estratégias de diagnóstico e de terapias eficientes para fazer face a este problema. Recentemente, vários estudos reconheceram diferentes MD como resultado de mutações em genes que codificam para as aminoacil-tRNA sintetases mitocondriais (mt-aaRSs), levando à identificação de várias variantes com potencial patológico. A função destas proteínas é catalisar a ligação entre um aminoácido e o seu respetivo RNA de transferência (tRNA) e assim assegurar a correta tradução das proteínas. No caso das mt-aaRSs, elas são codificadas a partir do genoma nuclear, e importadas para a mitocôndria onde desempenham a sua função na matriz mitocondrial. As mt-aaRSs são essenciais para a síntese das proteínas que constituem os complexos da cadeia respiratória, dado que estes complexos são codificados pelo genoma mitocondrial. Como tal, variantes patológicas destas proteínas associadas a MD, podem levar à síntese deficiente dos complexos, que em última instância pode causar disfunção mitocondrial. A grande maioria dos estudos relacionados com estas mutações tem-se focado essencialmente na parte clínica, sendo escassos os estudos ao nível dos aspetos bioquímicos e estruturais das proteínas e das respetivas variantes. O objetivo principal deste projeto é clarificar o mecanismo molecular das MD associadas a mutações em mt-aaRSs, estabelecendo uma correlação entre genótipo e fenótipo. Especificamente, este projeto de tese foca-se no estudo de duas mt-aaRSs humanas, a glutamil-tRNA sintetase mitocondrial (hEARS2) e a arginil-tRNA sintetase mitocondrial (hRARS2), proteínas cujas variantes proteicas foram reportadas como estando associadas a leucodistrofias. Especificamente, os objetivos deste trabalho foram a implementação de protocolos de expressão heteróloga e purificação de ambas as proteínas, e posteriormente a sua caracterização estrutural in vitro. Para as proteínas em estudo não há disponível, até à data, estrutura cristalográfica, neste sentido e de modo a ajudar nos estudos subsequentes, foram efetuados estudos in silico recorrendo a modelação das estruturas proteicas por homologia. Os modelos obtidos foram posteriormente comparados com os modelos obtidos pelo software AlphaFold (2021) e os resultados foram muito semelhantes. Para hEARS2, o modelo foi obtido a partir de EARS de T. thermophilus, e apresenta uma estrutura global aparentemente achatada e pouco compacta. Pode verificar-se ainda a existência predominante de hélices α, e também folhas β, mas em menor percentagem. Observa-se também a presença de vários loops. Relativamente a hRARS2, o modelo foi obtido a partir de RARS de S. cerevisiae e pela análise do modelo, visualiza-se uma estrutura global mais compacta com os elementos de estrutura secundária hélices α e folhas β presentes. Seguidamente investigou-se quais as melhores condições de expressão proteica em E. coli, para tal usou-se a estirpe Rosetta, adequada à expressão de codões nativos, de acordo com o plasmídeo disponível. Usando sempre o mesmo meio de crescimento (meio Luria Broth (LB)), testaram-se diferentes tempos de indução e quantidade de indutor, isopropil β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG), assim como diferentes temperaturas. Os perfis de expressão para hEARS2 e hRARS2 nas diferentes condições foram analisados por SDS-PAGE e Western blot. Desta análise observamos que ambas as proteínas são maioritariamente expressas na fração insolúvel, no entanto optou-se por dar preferência às condições que otimizavam a expressão na fração solúvel. Em relação à hEARS2 a condição ótima para expressão foi: crescimento durante 4 horas após indução com 0.5 mM IPTG a uma temperatura de 30 ºC e para hRARS2 foi crescimento durante 6 horas após indução com 1 mM IPTG a uma temperatura de 30 ºC. Posteriormente, nas condições otimizadas realizaram-se crescimentos bacterianos em grandes volumes (4 litros) a fim de obter quantidade suficiente de células para posterior purificação das respetivas proteínas. A partir das células obtidas preparou-se um extrato proteico solúvel que foi submetido seguidamente a uma cromatografia de afinidade com vista à obtenção de frações puras de cada uma das proteínas. Relativamente a hEARS2, o tampão utilizado para esta cromatografia continha 30 mM Tris-HCl pH 8.0, 300 mM NaCl, 20 mM-500mM imidazole (gradiente) e 20% glicerol. A fração correspondente a hEARS2 foi submetida seguidamente a uma cromatografia de exclusão molecular por desalting, de forma a trocar o tampão rapidamente e eliminar potenciais efeitos negativos por parte do imidazole e do sal. O tampão utilizado continha 30 mM Tris-HCl pH 8.0, 50 mM NaCl e 20% glicerol e a proteína foi armazenada a -80 ºC, com grau de pureza de cerca de 95%. No que diz respeito à proteína hRARS2, não nos foi possível estabelecer um protocolo otimizado para a purificação da mesma, sendo que das várias tentativas realizadas não se obteve uma fração com a pureza necessária. De seguida foram efetuados estudos relativamente à estrutura, ao folding e à estabilidade das proteínas recorrendo a técnicas biofísicas, como dicroísmo circular (CD) e espetroscopia de fluorescência, recorrendo à emissão dos triptofanos da proteína. Relativamente aos estudos estruturais da hEARS2, os resultados obtidos por CD mostram que a proteína possui uma estrutura secundária com α/β fold e uma temperatura de desnaturação aparente (Tm app) de 68 ºC, com uma transição cooperativa. Analisando a estrutura terciária da hEARS2 através de emissão de fluorescência dos triptofanos, os dados indicam que os 5 triptofanos presentes nesta proteína estão expostos ao solvente na sua forma nativa. A temperatura de desnaturação aparente obtida, monitorizando a alteração na estrutura terciaria, foi de 51 ºC, o que sugere que a estrutura terciária é perdida antes da estrutura secundária. Para a hEARS2 testou-se ainda qual o efeito do seu substrato, glutamato, na sua estrutura e estabilidade, para isso analisou-se o sinal de dicroísmo circular na região o far-UV. Os resultados obtidos sugerem que com o aumento das concentrações de substrato, a proteína perde a sua conformação inicial. No entanto, observa-se que a estabilidade proteica é mantida, uma vez que não há alteração do valor da temperatura desnaturação aparente. Relativamente à hRARS2, os estudos estruturais realizados têm um carater muito preliminar dado o grau de pureza da fração obtida. Os espectros de CD obtidos indicam que esta proteína terá possivelmente uma estrutura secundária α/β fold e uma temperatura de desnaturação aparente de cerca de 61 ºC. Observou se que a desnaturação térmica seguida por CD apresenta um perfil não cooperativo, provavelmente resultado da mistura de proteínas que compõe a amostra analisada. De acordo com os resultados obtidos da estrutura terciária, os triptofanos encontram-se igualmente expostos ao solvente, e após desnaturação térmica, foi obtida uma transição cooperativa com uma temperatura de desnaturação aparente de 53 ºC. No geral, efetuamos com sucesso a expressão e purificação de hEARS2, bem como conseguimos ter alguns resultados relativos à sua caracterização estrutural. Para hRARS2 conseguimos expressar a proteína, no entanto, a sua purificação necessita ser otimizada. Serão ainda necessários estudos mais aprofundados para complementar aspetos estruturais relevantes destas proteínas na sua forma wild-type, mas também estudos relativamente à estrutura e à conformação das respetivas variantes associadas a MD, em particular a leucodistrofias. O estudo detalhado ao nível da estrutura e função de variantes patológicas irá permitir perceber de que forma essas alterações genéticas se relacionam com estados patológicos. Desta forma, será possível determinar como é que estas mutações levam ao desenvolvimento de um fenótipo de doença, possibilitando também o desenvolvimento de terapias eficientes, capazes de mitigar os efeitos patológicos adjacentes às variantes de mt-aaRSs.Henriques, Bárbara J.Gomes, Cláudio M.Repositório da Universidade de LisboaFerreira, Diogo Miguel Fernandes Meireles202220212024-12-31T00:00:00Z2022-01-01T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/53544TID:202994600enginfo:eu-repo/semantics/embargoedAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2023-11-08T16:59:26Zoai:repositorio.ul.pt:10451/53544Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T22:04:30.637789Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse
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