Unveiling the role of deubiquitylating enzymes in plasma membrane repair

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Cardoso, Maria de Vasconcelos
Data de Publicação: 2020
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: eng
Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
Texto Completo: http://hdl.handle.net/10316/94275
Resumo: Dissertação de Mestrado em Investigação Biomédica apresentada à Faculdade de Medicina
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spelling Unveiling the role of deubiquitylating enzymes in plasma membrane repairDescobrir o papel das enzimas deubiquitinantes na reparação da membrana plasmáticaReparação da membrana plasmáticaEnzimas deubiquitinantesCélulas endoteliaisInsuficiência cardíaca com fração de ejeção preservadaPlasma membrane repairDeubiquitylating enzymesEndothelial cellsHeart failure with preserved ejection fractionDissertação de Mestrado em Investigação Biomédica apresentada à Faculdade de MedicinaCardiovascular diseases are the leading cause of death worldwide, regardless of the medical advances that have been made in the field. Among these diseases, heart failure with preserved ejection fraction (HFpEF) has gained more attention due to the lack of an efficient treatment, mostly due to the narrow knowledge on the biological processes behind it. Recently, HFpEF has been associated with endothelium dysfunction, nonetheless, the underlying mechanisms are still largely unknown.Plasma membrane repair (PMR) is an essential process for cell survival, due to the life-threatening environments that cells are submitted to. For example, endothelial cells (ECs) are continuously exposed to damaging mechanical forces employed by blood flow shear stress, however, the repair mechanisms that these cells use to cope with these injury-inducing conditions remain elusive. Therefore, it is conceivable that ECs are particularly dependent on an efficient PMR system, and so a compromised repair capacity may be the reason behind endothelium dysfunction.Given that the PMR process needs to happen within seconds to ensure cell homeostasis and survival, this repair system employs mechanisms canonically associated to other cellular functions, namely membrane trafficking. Underpinned by previous data from our group showing that AMSH and USP8, two deubiquitylating enzymes (DUBs) usually associated with the endosomal pathway, modulate the intracellular trafficking and stability at the plasma membrane (PM) of a membrane protein, we hypothesized that DUBs modulate the PMR process. Therefore, the objective of the present work is to enlighten the PMR mechanisms in ECs and to assess the role of two specific DUBs, AMSH and USP8, on the PMR process. Hence, we established an end point-based protocol to rapidly evaluate the PMR efficiency of cells whose PM injury was elicited with a pore-forming toxin named Streptolysin O (SLO) or saponin, a detergent known to also induce PM damage at low concentrations. The results obtained in this study hint that USP8 plays a role in PMR elicited either by SLO- or saponin-induced PM damage. Indeed, it was observed an inefficiency of PMR capacity in USP8-knockdown HeLa cells. Moreover, it was also observed a deficient repair capacity of AMSH-knockdown HeLa cells when subjected to SLO-induced PM injury. However, no differences were observed in cells challenged with saponin, suggesting that the PMR mechanisms triggered by these two PM damage inducers are different. Altogether, these findings suggest that USP8 and AMSH have an important role on the PMR system. Nevertheless, additional molecular and mechanistic studies are required to better understand their precise functional role and pathophysiological impact.As doenças cardiovasculares são a principal causa de morte no mundo, apesar dos avanços médicos alcançados na área. Dentro destas doenças, a insuficiência cardíaca com fração de ejeção preservada (ICFEP) tem ganho mais atenção devido à falta de um tratamento eficaz, principalmente devido a lacunas no conhecimento dos processos biológicos envolvidos na doença. Recentemente, a ICFEP tem sido associada à disfunção do endotélio, no entanto, os mecanismos subjacentes ainda são amplamente desconhecidos.A reparação da membrana plasmática (RMP) é um processo essencial para a sobrevivência celular, devido aos ambientes potencialmente letais aos quais as células são expostas. Por exemplo, as células endoteliais estão continuamente sujeitas a forças mecânicas prejudiciais originadas pelo shear stress induzido pelo fluxo sanguíneo, contudo, os mecanismos de reparação que estas células usam para lidar com essas condições indutoras de lesão permanecem indefinidos. Por isso, é plausível que as células endoteliais sejam particularmente dependentes de um sistema de RMP eficiente e, portanto, uma capacidade de reparação comprometida pode ser a razão por detrás da disfunção do endotélio.Uma vez que o processo de RMP necessita de ocorrer em segundos para garantir a homeostasia e sobrevivência celular, este sistema de reparação utiliza mecanismos canonicamente associados a outras funções celulares, nomeadamente no tráfego membranar. Com base em resultados anteriores do nosso grupo que mostram que a AMSH e a USP8, duas enzimas deubiquitinantes (DUBs) geralmente associadas à via endocítica, modulam o tráfego intracelular e a estabilidade na membrana plasmática (MP) de uma proteína de membrana, levantámos a hipótese de que as DUBs modulam o processo de RMP. Por isso, o objetivo deste trabalho é esclarecer os mecanismos de RMP em células endoteliais e avaliar o papel de duas DUBs específicas, AMSH e USP8, no processo de RMP. Consequentemente, estabelecemos um protocolo para avaliar rapidamente a eficiência de RMP de células cuja lesão na MP foi induzida com uma toxina formadora de poros chamada Streptolysin O (SLO) ou saponina, um detergente conhecido por também induzir danos na MP em baixas concentrações.Os resultados obtidos neste estudo sugerem que a USP8 desempenha um papel na RMP desencadeada por danos na MP induzidos por SLO ou saponina. De facto, foi observada uma ineficiência da capacidade de RMP em células HeLa com knockdown da USP8. Além disso, foi também observada uma deficiente capacidade de reparação em células HeLa com knockdown da AMSH quando sujeitas a dano na MP induzido por SLO. Contudo, não foram observadas diferenças em células incubadas com saponina, sugerindo que os mecanismos de RMP desencadeados por estes dois indutores de dano na MP são diferentes. De modo geral, estes resultados sugerem que a USP8 e a AMSH têm um papel importante no sistema de RMP. No entanto, estudos moleculares e mecanísticos adicionais são necessários para entender melhor o seu papel funcional preciso e o impacto patofisiológico.Outro - This work was financed by the European Regional Development Fund (ERDF), through the Operational Program for Competitiveness Factors (COMPETE; under the projects PAC “NETDIAMOND” POCI-01-0145-FEDER-016385; HealthyAging2020 CENTRO-01-0145-FEDER-000012-N2323; POCI-01-0145-FEDER-007440, CENTRO-01-0145-FEDER-032179, CENTRO-01-0145-FEDER-032414, POCI-01-0145-FEDER-022122; FCTUID/NEU/04539/2013, UID/NEU/04539/2019, UIDP/04539/2020; and FCT/PT2020-02/SAICT/2017_424 Repair).2020-12-162026-12-15T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesishttp://hdl.handle.net/10316/94275http://hdl.handle.net/10316/94275TID:202696561engCardoso, Maria de Vasconcelosinfo:eu-repo/semantics/embargoedAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2023-10-27T11:00:20Zoai:estudogeral.uc.pt:10316/94275Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T21:13:00.230757Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse
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