Computational study of pH-dependent membrane insertion mechanism of pHLIP peptides

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Silva, Tomás Fernandes da
Data de Publicação: 2017
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: eng
Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
Texto Completo: http://hdl.handle.net/10451/31983
Resumo: Tese de mestrado em Bioquímica, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2017
id RCAP_225c23b955fb7accef8444b8760e0fa2
oai_identifier_str oai:repositorio.ul.pt:10451/31983
network_acronym_str RCAP
network_name_str Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
repository_id_str 7160
spelling Computational study of pH-dependent membrane insertion mechanism of pHLIP peptidespHLIPpHREpKins-aPerfil de pKaMétodo de cutoff de distânciaTeses de mestrado - 2017Domínio/Área Científica::Ciências Naturais::Ciências QuímicasTese de mestrado em Bioquímica, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2017O pHLIP (pH low insertion peptide) pertence a uma família de péptidos derivados de um segmento da hélice transmembranar C da bacteriorodopsina. Este péptido consegue adoptar um de três possíveis estados: estado I - sem estrutura definida em solução de pH alto; estado II – adsorvido na superfície da membrana ainda sem estrutura definida; estado III - inserido ao longo da membrana adoptando uma hélice a na presença de valores baixos de pH. No caso do péptido pHLIP, o folding do mesmo sucede simultaneamente com o processo de inserção, sendo bastante dependente das interacções eletrostáticas que estabelece entre os seus resíduos e a membrana. Estas características do pHLIP proporcionaram um amplo estudo de possíveis aplicações terapêuticas, entre as quais como um biomarcador tumoral específico e como um transportador de fármacos para tecidos inflamados. O cerne destas aplicações prende-se com a especificidade do pHLIP para ambientes com valores de pH acídicos, principalmente células tumorais devido ao efeito de Warburg. Diferentes sequências deste péptido foram sintetizadas com o propósito de aumentar a especificidade do mesmo para as células tumorais, viabilizando métodos de tratamento e diagnóstico. No entanto, a especificidade do pHLIP é comprometida dado que acumula nos rins, devido ao pH naturalmente acídico. Desta forma, a acumulação de pHLIP nos rins tem sido abordada como uma limitação e um problema a resolver. Com este propósito, existe a necessidade de delimitar o intervalo de pH’s de inserção, somente permitindo inserção a moléculas que se encontrem dentro de um intervalo específico de pH. Ao iniciar esta tese, já tinham sido concretizadas diversas simulações do wt-pHLIP e de uma variante L16H utilizando o método de LRA (aproximação de resposta linear). Esta variante possui um resíduo catiónico na posição 16 e, segundo os resultados obtidos, confere dois pKins a , desta forma delimitando os pH’s nos quais pode inserir. Para obter estes resultados tinha sido utilizado um método de inserção média para avaliar o gradiente de exposição dos resíduos ao solvente, calculando qual o grau de inserção de cada um na membrana. Este método calcula a inserção de cada resíduo ao utilizar como referência a média das coordenadas Z dos grupos fosfato dos lípidos. Utilizando esta medida de inserção, é possível criar perfis de pKins a ao longo da normal da membrana. Estes perfis permitem avaliar os processos de inserção e saída ao caracterizar o comportamento entre os resíduos chave do pHLIP. Não obstante, o LRA e o método de calcular inserção usados possuem algumas limitações que não permitem a melhor descrição tanto do sistema wt como da variante L16H. Deste modo, tornou-se imperativo utilizar diferentes métodos de amostragem (o método de dinâmica molecular a pH constante, CpHMD, e o pH replica exchange, pHRE) para estudar o pHLIP e as suas variantes. Inicialmente, realizaram-se simulações de CpHMD do pHLIP wt e L16H para averiguar a qualidade do método, comparando com os resultados experimentais e os de LRA. Observou-se que o CpHMD também sofre de problemas de amostragem ao não conseguir amostrar estados ionizáveis dos resíduos em regiões de inserção próximas das caudas dos lípidos. Esta limitação impossibilita a previsão de curvas de titulação e, consequentemente, o cálculo de valores de pKa. O pHRE permite a troca de valores de pH entre réplicas (simulações independentes), levando a que os estados de protonação iniciais passem a ser estados de maior energia e, como tal, não favoráveis. Isto permite que estes sejam amostrados, mesmo que no decorrer da simulação os estados de protonação alterem para estados mais favoráveis, melhorando a amostragem a diferentes pH’s, contribuindo assim para o cálculo de curvas de titulação. O desenvolvimento de um método de inserção alternativo, o método de cutoff de distância, permite que zonas locais de deformação sejam correctamente amostradas ao ter em conta a média de coordenadas Z dos fosfatos da deformação. Assim sendo, quaisquer fosfatos que afectem a real superfície da membrana são atenuados na média. Para testar e averiguar a qualidade dos novos métodos desenvolvidos realizaram-se diversos grupos de simulações recorrendo ao wt-pHLIP e à variante L16H, onde foi possível variar os seguintes parâmetros: número de lípidos; frequência de tentativa de troca ; diferentes intervalos de pH. Na análise de resultados foi possível observar que o método de CpHMD apresenta falhas significativas na amostragem de estados ionizáveis de resíduos em regiões bastante inseridas. Isto deve-se ao método favorecer a amostragem de estados de protonação mais prováveis a um determinado pH, não garantindo que os estados menos prováveis sejam amostrados a diferentes phs equivalentemente. Ainda assim, o método do CpHMD conseguiu prever com um elevado grau de confiança o valor do pKins a do Asp14. Este valor é comparável ao valor de pKins experimental, o que nos leva a crer que o Asp14 adopta um papel importante na regulação dos processos de inserção e saída. Na sequência desta análise, aplicou-se o método de pHRE ao sistema de wt-pHLIP, estudando os diversos parâmetros referidos com o intuito de os optimizar para as simulações da variante L16H e futuras sequências. Observou-se através de medições de espessura da membrana que, ao utilizar uma membrana pré-equilibrada de 256 lípidos, existe uma região relativamente extensa não afectada pela presença do péptido. Deste modo, é possível reduzir o tamanho do sistema ao remover lípidos da membrana, levando a um aumento da velocidade de simulação, tornando o sistema mais eficiente. Com esse propósito, realizaram-se simulações com 128 lípidos, revelando-se comparáveis com as simulações de 256, sendo possível observar deformações locais semelhantes. Simultaneamente, estudou-se o impacto da utilização de diferentes valores de tRE e intervalos de pH na amostragem e probabilidades de troca. Constatou-se que a utilização de 20 ps e de 100 ps, em termos probabilísticos, é equivalente para o mesmo intervalo e salto de pH, pelo que o uso de 20 ps e um intervalo de pH’s de 4.0 a 7.5 pode-se revelar mais vantajoso pelo maior número de trocas que poderá efectuar, melhorando assim a amostragem dos estados de protonação. Deste modo, utilizaram-se os parâmetros aqui optimizados nas simulações de L16H com pHRE com o intuito de revalidar o efeito da histidina no processo de inserção do pHLIP. De forma semelhante ao LRA e CpHMD, foi possível observar um intervalo de pH onde ocorre a inserção do péptido pHLIP. Nesse intervalo, tanto o Asp14 como a His16 se encontram neutros ao inserir na membrana. Não obstante, o pHRE oferece uma melhor amostragem dos diferentes estados de protonação dos resíduos em regiões mais inseridas da membrana comparativamente ao CpHMD e LRA, resultando em perfis de pKa mais detalhados. Aliado a estes resultados, o pHRE conseguiu prever pKins a comparáveis, dentro da estimativa do erro, não só aos medidos com o CpHMD e LRA mas também aos resultados experimentais do Asp14 e His16. Relativamente aos resíduos aniónicos na região do C-terminal, observou-se que a sua inserção aparenta seguir uma ordem determinada pelos respectivos perfis de pKa. Deste modo, os processos de inserção e saída demonstram ser definidos pelo equilíbrio de cargas no C-terminal e o estado de protonação do Asp14, no caso do wt-pHLIP, e adicionalmente da His16, caso se trate da variante L16H. Em suma, ao conseguir estudar a variante L16H do pHLIP recorrendo ao método de pHRE, cumpriram-se os objectivos chave desta tese. Demonstraram-se as limitações inerentes do LRA e do CpHMD na amostragem neste sistema e optimizaram-se os parâmetros de simulação para o wt-pHLIP e possíveis variantes. Foi possível reproduzir o intervalo de pH’s de inserção para a L16H em concordância com dados experimentais ainda que estes não permitam atingir o propósito desejado de um uso terapêutico. Ainda assim, cimentaram-se as pedras basilares para futuros objectivos tais como: a calibração do método usando outras sequências testadas experimentalmente, revalidação de resultados obtidos com o método de LRA e, por fim, estudos de novas variantes do pHLIP usando diferentes resíduos catiónicos como a lisina e os seus derivados não-naturais de cadeia curta. Estes novos estudos traçam o caminho para, possivelmente, melhorar a eficiência na utilização do pHLIP como um método terapêutico no diagnóstico e tratamento de tumores.The pH (low) insertion peptide (pHLIP) belongs to a family of peptides originated from a segment of the transmembranar C helix of bacteriorhodopsin. The peptide has three major states that it may adopt when co-existing with lipidic membranes: state I - soluble and unstructured; state II - adsorbed at the membrane surface and unstructured; state III - inserted in the bilayer as an a-helix at low pH values. One of the major applications of pHLIP befalls on this ability to insert in membrane cells with an acidic vicinity, such as tumoral cells, thus working as an efficient tumor specific biomarker. However, wt-pHLIP has a major limitation, since it also accumulates in the kidneys in considerable amounts due to their naturally acidic extracellular pH. There is a need to increase pHLIP specificity by delimiting the pH range of insertion to further improve its application as a biomarker and possible drug-delivery system for inflammatory tissues. At the beginning of this thesis, several calculations were already performed with a linear response approximation (LRA) method for wt-pHLIP and some variant sequences. Additionally, it was calculated the solvent exposure of a residue when inserted in the membrane, defining insertion dependent pKa profiles. These profiles are crucial to understand the mechanism behind the withdrawal and insertion processes. However, there were some methodological limitations in LRA that propelled the need to use other sampling methodologies and a new L16H sequence to study the system. The main purpose of this thesis was to study pHLIP peptides using other sampling methodologies, namely constant-pH molecular dynamics (CpHMD) and pH-replica exchange (pHRE) methods, and evaluate the quality of the methods comparing with the LRA and experimental results. The CpHMD method presented some limitations sampling high-energy protonation states, revealing an insufficient amount of data to extensively describe pKa profiles. The newly developed pHRE method allows the exchange of pH values between replicas within a certain probability, thus facilitating transitions between energy minima and sampling of non-favorable protonation states, further enhancing the sampling of these states. Furthermore, the method to calculate insertion values was optimized. This new method is capable of defining local deformations and take them into account when calculating the insertion of the residues. Ultimately, these new methodologies were applied for simulations of wt-pHLIP and L16H variants. Several parameters were tested: number of lipids, different exchange frequency attempts and different pH ranges and steps. In summary, the pHRE method presented some remarkable results by overcoming the sampling limitations of the previous methods, allowing more detailed, accurate and consistent pKa profiles and pKins a of residues. Likewise, the new insertion method presented a robust and reliable method to depict the gradient of solvent exposure of a residue in the membrane. Moreover, the L16H results corroborated the LRA results, considering that the L16H variant is able to delimit the range of pH insertion, despite the DpKins a being too large for in vivo studies and therapeutic purposes. For the future, we now have the necessary tools to further expand the number of pHLIP sequences mutated with cationic residues, as to narrow down the pH range of insertion and evaluate the validity of these variants for clinical applications.Machuqueiro, Miguel Ângelo dos SantosVila Viçosa, Diogo Ruivo dos SantosRepositório da Universidade de LisboaSilva, Tomás Fernandes da2018-02-26T16:02:39Z201720172017-01-01T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/31983TID:201857456enginfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2023-11-08T16:25:54Zoai:repositorio.ul.pt:10451/31983Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T21:47:19.566242Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse
dc.title.none.fl_str_mv Computational study of pH-dependent membrane insertion mechanism of pHLIP peptides
title Computational study of pH-dependent membrane insertion mechanism of pHLIP peptides
spellingShingle Computational study of pH-dependent membrane insertion mechanism of pHLIP peptides
Silva, Tomás Fernandes da
pHLIP
pHRE
pKins-a
Perfil de pKa
Método de cutoff de distância
Teses de mestrado - 2017
Domínio/Área Científica::Ciências Naturais::Ciências Químicas
title_short Computational study of pH-dependent membrane insertion mechanism of pHLIP peptides
title_full Computational study of pH-dependent membrane insertion mechanism of pHLIP peptides
title_fullStr Computational study of pH-dependent membrane insertion mechanism of pHLIP peptides
title_full_unstemmed Computational study of pH-dependent membrane insertion mechanism of pHLIP peptides
title_sort Computational study of pH-dependent membrane insertion mechanism of pHLIP peptides
author Silva, Tomás Fernandes da
author_facet Silva, Tomás Fernandes da
author_role author
dc.contributor.none.fl_str_mv Machuqueiro, Miguel Ângelo dos Santos
Vila Viçosa, Diogo Ruivo dos Santos
Repositório da Universidade de Lisboa
dc.contributor.author.fl_str_mv Silva, Tomás Fernandes da
dc.subject.por.fl_str_mv pHLIP
pHRE
pKins-a
Perfil de pKa
Método de cutoff de distância
Teses de mestrado - 2017
Domínio/Área Científica::Ciências Naturais::Ciências Químicas
topic pHLIP
pHRE
pKins-a
Perfil de pKa
Método de cutoff de distância
Teses de mestrado - 2017
Domínio/Área Científica::Ciências Naturais::Ciências Químicas
description Tese de mestrado em Bioquímica, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2017
publishDate 2017
dc.date.none.fl_str_mv 2017
2017
2017-01-01T00:00:00Z
2018-02-26T16:02:39Z
dc.type.status.fl_str_mv info:eu-repo/semantics/publishedVersion
dc.type.driver.fl_str_mv info:eu-repo/semantics/masterThesis
format masterThesis
status_str publishedVersion
dc.identifier.uri.fl_str_mv http://hdl.handle.net/10451/31983
TID:201857456
url http://hdl.handle.net/10451/31983
identifier_str_mv TID:201857456
dc.language.iso.fl_str_mv eng
language eng
dc.rights.driver.fl_str_mv info:eu-repo/semantics/openAccess
eu_rights_str_mv openAccess
dc.format.none.fl_str_mv application/pdf
dc.source.none.fl_str_mv reponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informação
instacron:RCAAP
instname_str Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informação
instacron_str RCAAP
institution RCAAP
reponame_str Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
collection Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
repository.name.fl_str_mv Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informação
repository.mail.fl_str_mv
_version_ 1799134399619399680

Registros relacionados