Detection and inhibition of β-lactamase activity in clinical isolates of Escherichia coli combining β-lactamase and efflux inhibitors using an MTT-based method: phenotypic and genotypic validation

• Autor(a) principal: Serra, Débora Carvalho
• Data de Publicação: 2020
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: eng
• Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
• Texto Completo: http://hdl.handle.net/10362/97300
• topic: Escherichia coli; β-lactâmicos; β-lactamases; Bombas de efluxo; Inibidores de efluxo; MTT; Escherichia coli; β-lactams; β-lactamases; Efflux pumps; Efflux inhibitors; MTT; Ciências Médicas

RESUMO: A resistência aos antibióticos é uma ameaça cada vez maior na era da medicina moderna, na qual a resistência aos β-lactâmicos se tornou um tema premente uma vez que é a classe de antibióticos mais usada na clínica. Escherichia coli neutraliza os β-lactâmicos através da produção de β-lactamases, no entanto, a actividade de efluxo e redução da expressão de porinas também contribuem para este fenótipo de resistência. Neste trabalho, pretendemos optimizar um método colorimétrico económico para a detecção rápida de β-lactamases AmpC, β-lactamases de largo espectro (ESBLs), metallo-β-lactamases (MBLs), e carbapenemases, bem como a detecção simultânea de actividade de efluxo em E. coli para uso de rotina. As 27 estirpes clínicas de E. coli estudadas foram genotipadas por ERIC-PCR. A susceptibilidade aos antibióticos foi avaliada por Kirby-Bauer. As concentrações mínimas inibitórias (CMIs) dos β-lactâmicos foram determinadas na presença e ausência dos seguintes inibidores específicos de β-lactamases: cloxacillina para AmpC; clavulanato para ESBLs; EDTA para MBLs e ácido borónico para carbapenemases. As CMIs dos βlactâmicos foram também realizadas na presença e ausência dos inibidores de efluxo clorpromazina, “phearg-β-naphthylamide” (PAβN) e “carbonyl cyanide m-chlorophenyl hydrazone” (CCCP) em combinação com os inibidores de β-lactamases. As CMIs foram efectuadas usando o método de microdiluição em placa de 96 poços e MTT para detecção colorimétrica. Os resultados foram validados usando os métodos fenotípicos padrão para detecção de β-lactamases por difusão em disco e a detecção de genes que codificam βlactamases. A produção de β-lactamasesfoi detectada em todas as estirpes clínicas e incluiu a presença de AmpC, TEM com OXA-1, SHV, ou CTX-M ou sobrexpressão de AmpC. Foi possível reduzir as CMIs dos β-lactâmicos na presença dos inibidores de efluxo em combinação com os inibidores de β-lactamases demonstrando que, apesar da presença de β-lactamases, as CMIs dos β-lactâmicos podem ser reduzidas na presença de inibidores de efluxo. Neste trabalho, optimizámos um método para a detecção simultânea de β-lactamases AmpC, ESBLs, MBLs, carbapenemases e actividade de efluxo. Este método apresenta potencialidade para ser usado em países em desenvolvimento uma vez que é um método de fácil execução e não necessita de reagentes dispendiosos nem de equipamento especializado. Quando associado ao uso de um composto colorimétrico para a detecção, como o MTT, a interpretação dos resultados é directa uma vez que não está dependente do operador, evitando deste modo resultados falso-negativos bem como falsos-positivos. Baseado nos resultados obtidos, o efeito sinérgico observado entre inibidores de β-lactamases e inibidores de efluxo sugere um aumento da concentração de β-lactâmicos no interior da célula, aumentando assim a sua acção bactericida.