Characterization of α-GlcCer reactive iNKT cells and MAIT cells of Gaucher disease patients

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Lopes, Rafael Carneiro
Data de Publicação: 2020
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: eng
Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
Texto Completo: http://hdl.handle.net/10316/94238
Resumo: Dissertação de Mestrado em Investigação Biomédica apresentada à Faculdade de Medicina
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spelling Characterization of α-GlcCer reactive iNKT cells and MAIT cells of Gaucher disease patientsCaracterização das células iNKT reativas à α-GlcCer e das células MAIT em doentes de GaucherCélulas iNKTCélulas MAITDoença de GaucherAfinidade do TCRReatividade lipídicaiNKT cellsMAIT cellsGaucher diseaseTCR affinityLipid reactivityDissertação de Mestrado em Investigação Biomédica apresentada à Faculdade de MedicinaAs células Natural Killer T invariantes (iNKT) são um subtipo de células NKT que expressam um recetor de células T (TCR) semi-invariante. As células iNKT rapidamente produzem uma grande quantidade de citoquinas quando são estimuladas por antigénios e sugere-se que tenham um papel protetor na regulação do cancro e autoimunidade. Os antigénios que estimulam as células iNKT são lípidos apresentados no CD1d, uma molécula semelhante ao MHC (major histocompatibility complex) I, presente na superfície de células apresentadoras de antigénios. As células iNKT podem ser ativadas por lípidos endógenos e exógenos. O antigénio protótipo para ativação e identificação das iNKT é a α-galactosilceramida (α-GalCer). Recentemente, lípidos adicionais foram descritos, como a α-glucosilceramida (α-GlcCer). Por outro lado, as células T invariantes associadas à mucosa (MAIT) são uma população de linfócitos que partilham muitas semelhanças com as células iNKT. As células MAIT reconhecem antigénios não peptídicos apresentados numa molécula MHC I-like, MR1m e também têm uma cadeia α invariante do TCR. Os antigénios reconhecidos pelas MAIT são metabolitos microbianos derivados da síntese da riboflavina (vitamina B2). Há fatores pré-natais comuns a controlar o desenvolvimento das células iNKT e MAIT e há uma correlação positiva entre as frequências de ambas as populações em humanos. A doença de Gaucher é um distúrbio genético em que há defeitos no gene que codifica a enzima lisossomal β-glucosidase, causando uma acumulação de β-glucosilceramida (β-GlcCer) nas células.Neste estudo, quisemos avaliar se o armazenamento lisossomal anormal de β-GlcCer em doentes de Gaucher poderia alterar a reatividade das suas células iNKT à α-GlcCer. Assim, realizamos a caracterização das iNKT reativas à α-GlcCer destes pacientes. Foram também caracterizadas as suas células MAIT. Adicionalmente, quisemos aferir se as células iNKT de indivíduos saudáveis e doentes de Gaucher são reativas à α-GalCer e à α-GlcCer ou se há células iNKT que reagem apenas a um lípido. Assim, foram produzidos tetrâmeros CD1d carregados com estes lípidos, para marcar as iNKT de PBMCs (peripheral blood mononuclear cells). Testaram-se várias moléculas de streptavidina acopladas a fluorocromos durante a produção dos tetrâmeros de CD1d biotinilados para realizar experiências de co-marcação com tetrâmeros carregados com α-GalCer e α-GlcCer. Como não foi possível otimizar as experiências de co-marcação, as iNKT foram marcadas com tetrâmeros individuais. Não foram encontradas diferenças nas frequências e fenótipos de iNKT reativas a α-GalCer e α-GlcCer entre controlos e doentes. Ao juntar os indivíduos, observou-se que a percentagem de iNKT reativas à α-GalCer é mais alta que a percentagem de iNKT reativas à α-GlcCer (p<0.01). Além disso, a mediana da intensidade de fluorescência do tetrâmero CD1d carregado com α-GalCer foi significativamente maior que a do tetrâmero carregado com α-GlcCer (p<0.05). Em relação às MAIT, não houve diferenças significativas nas frequências e fenótipos entre doentes e controlos. A correlação positiva descrita na literatura entre células iNKT e MAIT também foi encontrada nos nossos controlos. No entanto, esta correlação estava ausente nos doentes de Gaucher.Concluindo, não se notou um efeito da acumulação da β-GlcCer na percentagem e fenótipos de iNKT reativas à α-GlcCer de doentes de Gaucher. Houve, porém, uma correlação alterada entre as iNKT e as MAIT. Além disso, há uma reatividade menor do TCR das iNKT à α-GlcCer, suplementando os resultados da literatura. Este estudo desvendou informação adicional sobre a biologia dos complexos CD1d-lípido-TCR das iNKT, assim como a relação entre as células iNKT e MAIT nos doentes de Gaucher.Invariant Natural Killer T (iNKT) cells are a subset of NKT cells that express a semi-invariant T cell receptor (TCR). iNKT cells rapidly produce large amounts of cytokines upon antigen stimulation and have been implied to have a protective role in the regulation of cancer and autoimmunity. The antigens that activate iNKT cells are lipids loaded onto CD1d, an MHC (major histocompatibility complex) I-like protein, present on the surface of antigen presenting cells. iNKT cells can be activated by both endogenous and exogenous lipids. The prototype antigen for iNKT activation and identification is α-galactosylceramide (α-GalCer). Recently, additional lipid antigens have been described, such as α-glucosylceramide (α-GlcCer). Mucosal associated invariant T cells (MAIT), on the other hand, are a lymphocyte population that shares many similarities to iNKT cells. MAIT cells recognize nonpeptide antigens presented in an MHC I-like molecule, MR1, and also have an invariant TCR α chain. The antigens recognized by MAIT cells are microbial metabolites derived from riboflavin (vitamin B2) synthesis. There are common prenatal environmental factors controlling the development of iNKT and MAIT cells, and there is a positive correlation between the frequencies of both populations in humans. Gaucher disease is a genetic disorder in which there are defects in the gene codifying the lysosomal enzyme β-glucosidase, causing an accumulation of β-glucosylceramide (β-GlcCer) in cells. In this study, we aimed to assess whether the abnormal lysosomal storage of β-GlcCer in Gaucher disease could alter the reactivity of the iNKT cells of its patients to α-GlcCer. Thus, we performed a characterization of the α-GlcCer reactive iNKT cells of these patients. We also performed a characterization of their MAIT cells. In addition, we wanted to the iNKT cells of healthy individuals and Gaucher patients are reactive to α-GalCer and α-GlcCer or if there are iNKT cells that react to a single lipid. For this purpose, CD1d tetramers loaded with these lipids were produced to stain iNKT cells from PBMCs (peripheral blood mononuclear cells). Several fluorochrome labelled streptavidin molecules were tested during the production of the biotinylated CD1d tetramers to perform co-staining experiments with α-GalCer and α-GlcCer loaded CD1d tetramers. As the optimization of the co-staining experiments was not possible, we decided to stain the iNKT cells with individual tetramers in separate tubes. Our results did not show differences in the frequencies and phenotypes of α-GalCer and α-GlcCer reactive iNKT cells between Gaucher patients and control subjects. When pooling the subjects together, we found that the percentage of α-GalCer reactive iNKT cells was higher than the percentage of α-GlcCer reactive iNKT cells (p<0.01). In addition, the median fluorescence intensity for the α-GalCer loaded CD1d tetramer was significantly higher than that of the α-GlcCer loaded tetramer (p<0.05). Regarding the MAIT cells, there were no significant differences in the frequencies and phenotypes between patients and controls. The positive correlation described between the literature between iNKT and MAIT cells was also found in our control subjects. However, this correlation was absent in our Gaucher patients. In conclusion, we did not observe an effect of the accumulation of β-GlcCer on the percentage and phenotypes of α-GlcCer reactive iNKT cells of Gaucher patients. There was, however, an altered correlation between iNKT and MAIT cells. In addition, there is a lower reactivity of the iNKT TCR to α-GlcCer, supplementing the results from the literature. This work brought additional data on the biology of the CD1d-lipid-TCR complexes of iNKT cells, as well as on the relationship between iNKT and MAIT cells in Gaucher patients.2020-12-092026-12-08T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesishttp://hdl.handle.net/10316/94238http://hdl.handle.net/10316/94238TID:202696596engLopes, Rafael Carneiroinfo:eu-repo/semantics/embargoedAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2023-10-27T11:00:18Zoai:estudogeral.uc.pt:10316/94238Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T21:12:58.442418Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse
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