Development of a real time PCR Methodology to detect systemic fungal infections
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| Data de Publicação: | 2021 |
| Tipo de documento: | Dissertação |
| Idioma: | eng |
| Título da fonte: | Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) |
| Texto Completo: | https://hdl.handle.net/1822/83131 |
Resumo: | Dissertação de mestrado em Bioquímica Aplicada (área de especialização em Biomedicina) |
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Development of a real time PCR Methodology to detect systemic fungal infectionsDesenvolvimento de uma Metodologia de PCR em tempo real para deteção de infeções fúngicas sistémicasMolecular diagnosisMultiplex quantitative PCRInvasive fungal infectionsInvasive aspergillosisInvasive mucormycosisInvasive candidiasisDiagnóstico molecularMultiplex PCR quantitativoInfeções fúngicas invasivasAspergilose invasivaMucormicose invasivaCandidíase invasivaCiências Naturais::Outras Ciências NaturaisDissertação de mestrado em Bioquímica Aplicada (área de especialização em Biomedicina)The work established aimed to adapt a previously developed methodology based on a multiplex PCR assay coupled with GeneScan analysis, to a quantitative PCR methodology (qPCR). This adaptation was related to the diagnostic preferences in hospital settings, since the commercially available qPCR methods are capable of delivering fast and accurate results, with low hands-on time, in an entirely closed system with a reduced likelihood of contamination. With qPCR methods the diagnosis can be attributed as the reaction ends, with no need of samples transfer for PCR products analysis, which takes extra time. This qPCR method uses SYBR Green and melting curve for PCR products analysis. The use of primers designed outside the ITS regions enhances the specificity and reduces cross-amplification of the methodology. Two panels previously designed in our laboratory were evaluated, the Candida Panel, and the Filamentous Fungi Panel. Regarding the adaptation of the Candida Panel, this conversion was not possible since the PCR products of each species had very similar melting temperature values. Regarding the Filamentous Fungi Panel, the melting temperature values obtained for each species were very distinct from each other which allowed to identify and distinguish the most prevalent pathogens associated with invasive aspergillosis (Aspergillus fumigatus, A. niger, A. flavus and A. terreus), and invasive mucormycosis (Rhizopus arrhizus), as well as coinfections in a qPCR multiplex reaction. The qPCR method was also able to detect samples with low amounts of fungal gDNA, explicitly 1.3 pg/μL for A. fumigatus and R. arrhizus, 13 pg/μL for A. flavus and A. niger, and 33 pg/μL for A. terreus. When human plasma was spiked with fungal DNA, the methodology was still able to distinguish and correctly identify the fungal pathogens. No false-positive results were obtained with nontarget species, including bacteria or human DNA. Thus, this work provides evidence for the possibility of the adaptation of the Filamentous Fungi Panel to a qPCR multiplex methodology, as well as the potential diagnostic capability of this method for the identification of the most relevant filamentous fungi involved in invasive fungal infections.O trabalho desenvolvido teve como objetivo adaptar uma metodologia anteriormente desenvolvida, baseada em PCR em multiplex acoplado a uma análise por GeneScan, para uma metodologia de PCR em tempo real quantitativo (qPCR). Esta adaptação está associada aos requisitos em meio hospitalar, uma vez que as metodologias qPCR possuem a capacidade de garantir resultados eficazes de forma rápida, com pouco tempo de manuseamento humano, num sistema inteiramente fechado, com menor possibilidade de haver contaminação. Graças a estas metodologias, pode ser atribuído um diagnóstico assim que a reação de qPCR termine, sem que haja transferência de produtos de PCR para análise, o que envolve tempo extra. A metodologia aptada neste estudo utiliza SYBR Green, e as curvas de melting para analisar os produtos de PCR. Os primers desenhados fora da região ITS reduz amplificações cruzadas, mantendo a especificidade da metodologia. Dois painéis previamente desenhados no nosso laboratório foram avaliados, o Candida Panel e Filamentous Fungi Panel. Em relação ao Candida Panel, esta adaptação não foi possível, uma vez que os produtos de PCR de cada espécie apresentavam um valor de temperatura de melting muito semelhante entre si. No entanto, para o Filamentous Fungi Panel, os produtos de PCR obtiveram valores de temperatura de melting claramente distintos, mostrando-se capaz de identificar e distinguir os agentes patogénicos comumente associados à aspergilose invasiva (Aspergillus fumigatus, A, niger, A. flavus e A. terreus) e a mucormicose invasiva (Rhizopus arrhizus), e também infeções mistas por qPCR em multiplex. A metodologia de qPCR mostrou-se ainda eficaz em detetar quantidades muito reduzidas de ADN fúngico, nomeadamente 1.3 pg/μL para A. fumigatus e R. arrhizus, 13 pg/μL para A. flavus e A. niger, e 33 pg/μL para A. terreus. Quando introduzimos ADN de cada espécie fúngica em plasma humano, a metodologia foi ainda capaz de identificar e distinguir todas as espécies incluídas no painel. Não foram identificadas falso-positivos com espécies não estavam incluídas no painel, incluindo bactérias. Este trabalho evidencia a possibilidade de adaptação do painel Filamentous Fungi Panel para qPCR em multiplex e o potencial de diagnóstico desta metodologia para a identificação dos fungos filamentosos mais relevantes, e associados a infeções fúngicas invasivas.Sampaio, PaulaFranco-Duarte, RicardoUniversidade do MinhoMendonça, Paulo Alexandre Silva20212021-01-01T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttps://hdl.handle.net/1822/83131eng203053133info:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2023-07-21T12:36:21Zoai:repositorium.sdum.uminho.pt:1822/83131Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T19:32:24.335986Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse |
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Development of a real time PCR Methodology to detect systemic fungal infections Mendonça, Paulo Alexandre Silva Molecular diagnosis Multiplex quantitative PCR Invasive fungal infections Invasive aspergillosis Invasive mucormycosis Invasive candidiasis Diagnóstico molecular Multiplex PCR quantitativo Infeções fúngicas invasivas Aspergilose invasiva Mucormicose invasiva Candidíase invasiva Ciências Naturais::Outras Ciências Naturais |
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