New potential therapy for multiple slerosis : a role for adenosine A2A receptors

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Afonso, Cláudia Filipa Martins, 1989-
Data de Publicação: 2017
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: eng
Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
Texto Completo: http://hdl.handle.net/10451/33968
Resumo: Tese de mestrado, Neurociências, Universidade de Lisboa, Faculdade de Medicina, 2017
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spelling New potential therapy for multiple slerosis : a role for adenosine A2A receptorsOligodendrócitosEsclerose múltiplaZona subventricularAdenosinaReceptores A2ATeses de mestrado - 2017Domínio/Área Científica::Ciências MédicasTese de mestrado, Neurociências, Universidade de Lisboa, Faculdade de Medicina, 2017Oligodendrocytes are the cells responsible for myelinating neuronal axons in the Central Nervous System (CNS). The emergence of the myelin sheath was an important evolutionary step in vertebrate development, since it allows the rapid propagation of action potentials while preserving axonal diameter and reducing the metabolic costs of neuronal activity. Thus, its disruption constitutes a serious health problem, altering the normal signal transmission between neurons and initiating a degenerative process that affects proper motor and cognitive ability. Multiple sclerosis (MS) is the most prevalent demyelinating disease worldwide. It is primarily characterized by the presence of inflammatory infiltrates, oligodendrocyte death and destruction of myelin in CNS areas known as plaques. No cure is available and currently the therapeutic strategies target exclusively its immune component, thus being only partially effective as disease continues to progress. During the clinical course of MS, attempts at remyelination occur, with new oligodendrocytes generated mostly from brain parenchymal oligodendrocyte progenitor cells (OPCs). However, a minority of these OPCs are derived from neural stem cells (NSCs) present in the subventricular zone (SVZ) along the lateral ventricles. This spontaneous repair process raises reasonable hopes that recruitment of OPCs towards sites of injury may constitute a novel therapeutic approach in MS. Numerous studies have independently established the involvement of the adenosinergic system in the pathogenesis of MS, specifically of A1 and A2A adenosine receptors. Moreover, previous data from our group has demonstrated that activation of A2ARs promoted the differentiation of oligodendrocytes from neurosphere cultures of postnatal rats. Thus, the present thesis investigated the possible modulatory role of A2ARs in SVZ oligodendrogenesis in vivo, under physiological conditions, and in SVZ and parenchymal oligodendrogenesis ex vivo, using forebrain organotypic slice cultures. Surprisingly, the results concerning the in vivo experiments demonstrated that activation of A2ARs decreases the proliferation of OPCs (Olig2+BrdU+ cells) in the SVZ. Moreover, the movement of these cells along the rostral migratory stream (RMS) towards the olfactory bulb (OB) was impaired following A2AR activation. However, the number of SVZ-generated OPCs in the OB was not significantly altered in treated animals when compared to controls. In contrast, the data regarding the ex vivo experiments suggests that A2AR activation promotes parenchymal OPC maturation in the absence of a demyelinating event, since an increase in the fluorescence intensity of myelin basic protein (MBP) was observed. In summary, the results presented in this thesis indicate that activation of A2ARs decreases the proliferation and migration of SVZ-derived OPCs. Moreover, A2AR activation appears to play a positive role in parenchymal oligodendrogenesis through increased OPC differentiation in non-demyelinated organotypic cultures. These biological effects of A2ARs might prove to be important in the future development of novel therapeutic strategies in MS.No Sistema Nervoso Central (SNC) os oligodendrócitos são as células responsáveis pela mielinização dos axónios neuronais. O aparecimento da mielina, uma membrana multilamelar composta maioritariamente por lípidos e proteínas, constituiu um passo evolutivo importante para os vertebrados, uma vez que possibilita a rápida propagação dos potenciais de acção, preservando o diâmetro axonal e reduzindo os custos metabólicos da actividade neuronal. Deste modo, a sua disrupção ou eventual perda modifica a transmissão sináptica entre os neurónios e inicia um processo degenerativo, afectando as capacidades motoras e cognitivas. A esclerose múltipla (EM) é a doença desmielinizante de maior prevalência mundial. Do ponto de vista fisiopatológico, é caracterizada pela infiltração no SNC de leucócitos sistémicos, que promovem a destruição da mielina em zonas denominadas de placas. Actualmente, não existe cura e as estratégias terapêuticas disponíveis visam exclusivamente a sua componente imunitária, sendo apenas parcialmente eficazes à medida que a doença progride no tempo. Numa proporção considerável de doentes, durante a evolução clínica da EM é possível observar-se remielinização. Assim, a intervenção neste processo de reparação espontâneo, que envolve a proliferação e migração de células precursoras de oligodendrócitos (OPCs) para os locais de dano, poderá constituir uma nova abordagem terapêutica na EM. A diferenciação de oligodendrócitos é um processo extremamente regulado e dinâmico que ocorre maioritariamente durante o período pós-natal a partir de OPCs do parênquima que expressam o proteoglicano NG2 (nerve-glial antigen 2). Uma percentagem significativa destas células permanece num estado proliferativo no SNC adulto, constituindo cerca de 5-8% de toda a população glial. Durante o processo de remielinização observado em doentes com EM, a maioria dos oligodendrócitos que são recrutados para os locais de dano é derivada destes OPCs parenquimatosos. No entanto, uma percentagem pequena advém de células estaminais neurais presentes na zona subventricular (SVZ) situada ao longo dos ventrículos laterais. A SVZ constitui no SNC dos mamíferos adultos o principal nicho de células estaminais, sendo capaz de dar origem a neurónios e células da glia. A adenosina é um nucleósido endógeno da classe das purinas que se encontra presente em todas as células. É produzida sobretudo a partir do catabolismo da adenosina trifosfato (ATP) e no SNC exibe um papel duplo de regulador homeostático e de neuromodulador da transmissão sináptica através da activação de quatro receptores metabotrópicos: A1, A2A, A2B e A3. Enquanto que os receptores A1 e A3 estão negativamente acoplados à adenilato ciclase, os receptores A2A e A2B estimulam a actividade desta enzima, aumentando assim a produção de adenosina 3’,5’-monofosfato cíclico (cAMP). Diferentes estudos comprovaram de forma independente o envolvimento do sistema adenosinérgico na patogénese da EM. Em particular, foi demonstrado que os receptores A2A estão sobre-expressos em linfócitos e na substância branca destes doentes. Na encefalomielite auto-imune experimental (EAE), o modelo animal mais usado no estudo da EM, o nível de expressão dos receptores A2A encontra-se também aumentado em linfócitos T e na microglia. Estes receptores estão igualmente envolvidos no processo de oligodendrogénese, já que se encontra descrito que a sua activação inibe a proliferação in vitro de OPCs. Dados prévios do nosso grupo de investigação mostraram que a activação destes receptores com o agonista selectivo CGS21680 (30 nM) promove a diferenciação de OPCs derivados de neuroesferas da SVZ. Assim, a presente dissertação teve por objectivo estudar o possível papel modulador dos receptores A2A na oligodendrogénese derivada da SVZ in vivo em condições fisiológicas e ex vivo na oligodendrogénese derivada do parênquima e SVZ antes e após insulto desmielinizante com lisofosfatidilcolina usando culturas organotípicas corticais. Para estudar o efeito da activação dos receptores A2A na oligodendrogénese derivada da SVZ in vivo, introduziu-se no ventrículo lateral direito de ratos Wistar com 6 semanas de idade uma cânula ligada a uma mini-bomba osmótica, a partir da qual o agonista CGS21680 (100 nM) ou veículo (líquido cefalorraquidiano artificial) foram continuamente administrados durante 28 dias. A proliferação celular foi avaliada após duas injecções intraperitoneais de 5-bromo-2’-deoxiuridina (BrdU, 100 mg/kg de peso corporal), separadas entre si por intervalos de 2 horas no último dia de tratamento. Para analisar a migração e diferenciação celulares, os animais receberam injecções de BrdU duas vezes ao dia nos primeiros 3 dias de administração farmacológica. Os animais foram sacrificados, os seus cérebros removidos e seccionados em fatias coronais com 30 μm de espessura. Posteriormente, procedeu-se à técnica de imuno-histoquímica por fluorescência contra Olig2, um factor de transcrição cuja expressão é mantida em toda a linhagem oligodendrocítica, e BrdU. Para investigar o efeito da activação dos receptores A2A na oligodendrogénese ex vivo derivada da SVZ e parênquima antes e após um insulto desmielinizante com lisofosfatidilcolina (LPC, 0.5 mg/ml), preparam-se culturas organotípicas corticais contendo a SVZ e o corpo caloso. De forma resumida, os cérebros de ratos Sprague-Dawley foram removidos e cortados em fatias coronais de 400 μm de espessura que foram colocadas em cultura sobre membranas semi-porosas a 37 oC. Realizaram-se dois protocolos experimentais distintos. No protocolo 1, as fatias foram isoladas de ratos P9 e mantidas em meio MEM até ao dia in vitro (DIV) 4, tendo sido então mudadas para meio Neurobasal-A (NB-A). Ao DIV 6, as fatias foram incubadas com LPC ou veículo (etanol) durante 18 horas, tendo-se procedido de seguida ao tratamento farmacológico com o agonista CGS21680 (30 nM) e/ou antagonista ZM241385 (50 nM). Após 36 horas, as fatias foram finalmente fixadas. No protocolo 2, as fatias foram isoladas de ratos P14 e mantidas em meio MEM até ao DIV 1, tendo sido então mudadas para meio NB-A e incubadas com LPC durante 18 horas. Seguiu-se o tratamento farmacológico com o agonista CGS21680 (30 nM) e/ou antagonista ZM241385 (50 nM) e após 36 horas procedeu-se à fixação das fatias. A intensidade de fluorescência da proteína básica de mielina (MBP), um marcador de oligodendrócitos maduros, foi medida no corpo caloso das fatias organotípicas. De forma inesperada, os resultados do estudo in vivo demonstraram que a activação dos receptores A2A provoca uma redução da proliferação de OPCs (células Olig2+BrdU+) na SVZ. Além disso, o movimento destas células ao longo da via rostro-migratória (RMS) em direcção ao bolbo olfactivo (OB) encontra-se inibido após activação dos receptores A2A. No entanto, observou-se que não há uma alteração significativa no número de OPCs derivados da SVZ presentes no OB entre animais controlo e tratados com o agonista CGS21680. Por outro lado, os resultados das experiências ex vivo mostraram que a activação dos receptores A2A promove a maturação dos OPCs na ausência de um evento desmielinizante, uma vez que se observou um aumento na intensidade de fluorescência de MBP. A incubação das fatias com LPC a 0.5 mg/ml durante 18 horas não foi suficiente para induzir a desmielinização do corpo caloso. No entanto, o aumento da intensidade de fluorescência de MBP registado com a activação dos receptores A2A não foi replicado quando o tratamento com o agonista se seguiu à incubação com LPC, o que pode indicar que, mesmo a uma concentração insuficiente para provocar desmielinização, este agente tem algum efeito. Na sua totalidade, os resultados apresentados nesta dissertação indicam que a activação dos receptores A2A modula a oligodendrogénese derivada da SVZ, inibindo a proliferação e migração de OPCs para o OB. Contudo, a activação destes receptores parece desempenhar um papel positivo na oligodendrogénese derivada do parênquima, através do aumento da diferenciação de OPCs. Esta função dupla dos receptores A2A pode revelar-se importante para o desenho de novas estratégias terapêuticas na EM.Xapelli, Sara AlvesCastro, Cláudia Valente deRepositório da Universidade de LisboaAfonso, Cláudia Filipa Martins, 1989-2021-06-20T00:30:14Z20172017-01-01T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/33968TID:201712636enginfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2023-11-08T16:28:58Zoai:repositorio.ul.pt:10451/33968Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T21:48:47.087296Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse
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