Metabolic remodeling of endothelial cells upon hypoxia and β-blockers as anti-angiogenic drugs

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Martins, Filipa Alexandra Dias
Data de Publicação: 2019
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: eng
Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
Texto Completo: http://hdl.handle.net/10451/40477
Resumo: Tese de mestrado, Biologia Molecular e Genética, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2019
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spelling Metabolic remodeling of endothelial cells upon hypoxia and β-blockers as anti-angiogenic drugsCélulas endoteliaisAngiogeneseMicroambiente tumoralHipoxiaPropranololTeses de mestrado - 2019Departamento de Biologia VegetalTese de mestrado, Biologia Molecular e Genética, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2019Angiogenesis occurs when new blood vessels sprout from pre-existing ones through proliferation of endothelial cells (ECs). This process plays a major role in several physiological and pathophysiological processes, including atherosclerosis, chronic inflammation and cancer. The tumor associated neovasculature is responsible for the supply of nutrients and oxygen, promoting tumor growth and metastasis, even though these blood vessels are structurally and functionally abnormal. During tumor progression, rapid and uncontrolled proliferation of tumor cells occurs, leading to a hypoxic microenvironment with insufficient blood supply. Therefore, tumor cells start to release pro-angiogenic factors, such as VEGF (vascular endothelial growth factor), and hypoxia leads to the stabilization of HIF-1α (hypoxia-inducible factor 1 α), inducing the expression of genes that will stimulate the formation of a new vessel. The first objective of this thesis was to unravel the hypoxia effect in metabolic remodeling during the endothelial cell activation. An NMR (nuclear magnetic resonance) analysis of HUVECs (human umbilical vein endothelial cells) exposed to CoCl2-mimicked hypoxia showed decreased lactate and 2-hydroxyisobutyrate extracellular levels in hypoxia. In addition, an increase of intracellular formate levels was detected in hypoxia, which suggests a proliferating phenotype due to formate involvement in purine synthesis. On the other hand, there was a decrease in the intracellular levels of glucose, lactate and acetate upon exposure to hypoxia, precursors of pyruvate. Concerning endothelial activation upon hypoxia, an in vitro tube forming assay was performed and indicated a promotion of vessel-like structures formation by hypoxia. However, in an ex vivo rat aortic ring assay the exposition to CoCl2 resulted in sprouting inhibition. Besides, a wound healing assay demonstrated a migration inhibition on cells exposed to CoCl2. This makes us wonder if the concentration of CoCl2 used is actually mimicking hypoxia. Cysteine (Cys) is an important ROS (reactive oxygen species) scavenger, showed to have an involvement in cancer cell remodeling. Since ROS act as pro-angiogenic molecules, we had the intent to investigate the effect of Cys in endothelial activation. An aortic ring assay showed a tendency for a sprouting increase when exposed to Cys and higher branch points density when exposed to H2O2. However, these levels decreased when exposed to Cys and H2O2, what suggests that ROS may play a role in inducing angiogenesis, being Cys able to somehow revert this process. Many anti-angiogenic strategies were developed over the years, but they have failed mostly because the mechanisms involved in neoangiogenesis are not fully understood. Propranolol (a nonselective β-blocker) has emerged as an effective treatment for infantile hemangiomas, leading to its regression. Hence, our second objective was to determine the effect of propranolol in neo-angiogenesis. A tube forming assay was performed and showed that propranolol inhibited the formation and destroyed the already formed vessel-like structures. Its inhibitory effects extended to migration, without affecting cell viability. Besides, an immunofluorescence assay showed that propranolol affected the expression of some EC markers, particularly when the exposure was shorter. The effect was also accessed ex vivo, in which propranolol inhibited the sprout of endothelial cells from the aortic ring, corroborating the in vitro results. The metabolic remodeling involved during aortic ring sprouting was also accessed by NMR spectroscopy, showing the differential expression of metabolites from different pathways, glycolysis, aminoacyl-tRNA biosynthesis, valine, leucine and isoleucine biosynthesis and degradation. This study gives some insights into the metabolic remodeling induced by hypoxia in endothelial cells, opening new cues on the metabolic adaptation underlying angiogenesis which, despite being a process involving non-cancerous cells it accounts for cancer progression. The results on the effect of propranolol in angiogenesis reinforces its use as a therapeutic alternative to target angiogenesis and treat cancer not only vascular tumors, being a starting point to further investigations on the mechanisms underlying its action.A angiogenese ocorre quando novos vasos sanguíneos se formam a partir dos já existentes devido a proliferação de células endoteliais (ECs). Estas células que compõem o revestimento do lúmen do coração (endocárdio) e dos vasos sanguíneos e linfáticos, tem a capacidade de permanecer quiescentes por anos e rapidamente mudar para um estado de ativação em resposta a estímulos. E o equilíbrio entre fatores pro e anti-angiogénicos que determina o nível de angiogenese em curso. Quando as ECs são estimuladas por fatores pro-antigénicos, como o VEGF-A (fator de crescimento endotelial vascular), há um aumento na proliferação, migração e diferenciação de ECs, levando a formação de um novo vaso. A angiogenese desempenha um papel importante em vários processos fisiológicos, como durante o reparo de tecidos e o ciclo reprodutivo feminino, sendo também temporariamente ativada em processos fisiopatológicos, incluindo aterosclerose, inflamação cronica e cancro. Durante a progressão tumoral, ocorre uma proliferação rápida e descontrolada de células tumorais, levando a um microambiente hipóxido com fornecimento insuficiente de sangue contendo nutrientes e oxigénio. Como tal, as células tumorais começam a libertar fatores pró-angiogénicos. Alem disso, a hipoxia leva a estabilização do HIF-1α (HIF: fator induzido por hipoxia), que dimeriza com o HIF-1β no núcleo e atua como fator de transcrição de genes com elementos responsivos a hipoxia (HRE), tal como o VEGF. Portanto, a hipoxia tem um impacto na função das células endoteliais e na angiogenese, dado o aumento da taxa glicolítica e a proliferação de ECs devido a indução da expressão de genes envolvidos na glicólise. Descobertas recentes sugerem que a comunicação entre as células presentes no microambiente tumoral e simbiótica, de modo a suportar a remodelação metabólica do tumor. Como tal, há partilha de moléculas orgânicas e de sinalização entre os diferentes tipos de células, cooperando para a sobrevivência do sistema. Esta relação e ainda mais importante para as células tumorais quando o acesso a nutrientes e muito baixo, contribuindo com novas fontes de energia e biomassa. Deste modo, o conhecimento das interações metabólicas poderá auxiliar na identificação de novos candidatos a alvos terapêuticos para o tratamento do cancro. O primeiro objetivo desta tese foi investigar o efeito da hipoxia na remodelação metabólica durante a ativação das células endoteliais que poderá ocorrer no microambiente tumoral. Uma analise por espetroscopia de ressonância magnética nuclear (RMN) de HUVECs (células endoteliais da veia umbilical humana) expostas a hipoxia mimetizada por CoCl2 mostrou níveis reduzidos de lactato em hipoxia, tanto intra- quanto extracelulares. No meio extracelular também foi detetado um nível inferior de 2-hidroxi-isobutirato em hipoxia em comparação a normoxia, um metabolito associado a via de degradação de valina, leucina e isoleucina. Alem disso, em hipoxia foi detetado um aumento nos níveis de formato intracelular, o que pode indicar um fenótipo proliferativo devido ao envolvimento do formato na síntese de purinas. Pelo contrario, houve uma diminuição dos níveis intracelulares de glucose, lactato e acetato apos exposição a hipoxia. Em relação a ativação endotelial apos hipoxia, foi realizado um ensaio de tube forming no qual HUVECs embutidas em matrigel são estimuladas a formar estruturas semelhantes a vasos, criando uma rede que simula o que ocorre in vivo. Assim, as HUVECs foram expostas a normoxia e a CoCl2 para mimetizar a hipoxia, observando-se uma estimulação da formação de estruturas semelhantes a vasos por hipoxia. No entanto, foi realizado um ensaio ex vivo, o rat aortic ring assay, no qual a exposição a CoCl2 resultou numa inibição da formação de ramificações de células endoteliais (sprouting) a partir do anel. Alem disso, um ensaio de wound healing demonstrou inibição da migração em células expostas a hipoxia induzida por CoCl2. Tal faz-nos questionar se as concentrações de CoCl2 utilizadas constituem um modelo eficiente para estudo dos efeitos da hipoxia em células ECs. A cisteina e um importante scavenger de reactive oxygen species (ROS), estando já demonstrado o seu papel na remodelação metabólica de células tumorais. Visto que as ROS atuam como moléculas pro-angiogenicas, decidimos investigar o efeito da cisteína na ativacao endotelial. Um ensaio do aortic ring mostrou uma tendência para um aumento de sprouting quando exposto a cisteína, em normoxia e hipoxia, o que vai contra o esperado, visto que a eliminação dos ROS estaria associada a uma inibição da angiogenese. Para assegurar a existência de stress oxidativo, o ensaio foi também realizado na presença de H2O2, sendo que este induziu uma maior densidade de branching points comparando com o controlo. Porem estes níveis decresceram quando as células foram expostas a cisteína e H2O2, o que confirmou que os ROS poderão ter um papel na estimulação da angiogenese, sendo que a cisteína e capaz de reverter esse processo. Em relação a migração endotelial, num ensaio de wound healing observou-se que nem a cisteína nem o H2O2 afetaram a migração das ECs. Deste modo, e necessário verificar o papel da eliminação de ROS na angiogenese, de modo a determinar se uma estratégia terapêutica anti-ROS sera uma boa aposta para perturbar a angiogenese tumoral. Muitas estratégias terapêuticas anti-angiogenicas foram desenvolvidas ao longo dos anos, mas falharam principalmente porque os mecanismos envolvidos na neoangiogenese ainda não são totalmente compreendidos. Algumas estratégias objetivam a destruição da vasculatura, afetando a sobrevivência do tumor. Contudo, ao contrario do que seria pretendido, um microambiente tumoral mais pobre em O2 (hipoxia) pode servir de estimulo a neoangiogenese. Portanto, o desenvolvimento de novas terapias antiangiogenicas eficazes e urgente. O propranolol e um β-bloqueador não seletivo, isto e, bloqueia os recetores adrenérgicos β1 e β2 com igual afinidade. Estes recetores são ativados pela epinefrina e norepinefrina, estando o seu bloqueio associado ao tratamento de hipertensão, miocardites, enxaquecas, transtornos de ansiedade e tremores. Nos últimos anos o propranolol surgiu como um tratamento para os hemangiomas pediátricos, mostrando-se eficaz na regressão destes tumores por vasoconstrição. No entanto, o seu mecanismo de ação sobre as ECs e funcionamento dos vasos permanece sob investigação. Assim, o nosso segundo objetivo foi estudar o efeito do propranolol na neoangiogenese, uma vez que os β-bloqueadores poderão ser uma estratégia potencialmente eficaz para perturbar a angiogenese tumoral. Foi realizado um ensaio de tube forming no qual o propranolol inibiu a formação de novas estruturas semelhantes a vasos e destruiu as ja formadas. Os seus efeitos inibitorios estenderam-se a migração, conforme observado num ensaio de wound healing no qual HUVECs foram expostas a este fármaco, na presença e ausência de ROS (H2O2). Uma analise de morte celular por citometria de fluxo indicou que o propranolol não afetou a viabilidade celular. Alem disso, um ensaio de imunofluorescência mostrou que o propranolol afetava a expressão de alguns marcadores endoteliais (ICAM, VCAM, CD146, vWF), principalmente em tempos de exposição mais curtos. O efeito também foi avaliado ex vivo através de um aortic ring sprouting assay, no qual o propranolol inibiu a formação de estruturas a partir do anel, corroborando os resultados in vitro. Estes resultados sugerem que o propranolol podera perturbar a angiogenese in vitro, sendo necessários mais estudos de modo a investigar o mecanismo envolvido e qual e o recetor adrenérgico, β1 ou β2, responsável pela ativação das vias de sinalização envolvidas na inibição da angiogenese. A remodelação metabólica envolvida durante o sprouting do anel aórtico também foi avaliada por espetroscopia de NMR, mostrando a expressão diferencial de metabolitos de diferentes vias metabólicas, incluindo glicólise, biossíntese de purinas, biossíntese e degradação de valina, leucina e isoleucina. Este estudo fornece algumas ideias sobre a remodelação metabólica induzida pela hipoxia nas ECs, abrindo novas perspetivas sobre a adaptação metabólica subjacente a angiogenese que, apesar de ser um processo que envolve células não-malignas, e responsável pela progressão do cancro. Os resultados do efeito do propranolol na angiogenese reforçam a sua aplicação como alternativa terapêutica anti-angiogenica no tratamento do cancro, não apenas dos tumores vasculares, sendo um ponto de partida para novas investigações sobre os mecanismos subjacentes a sua ação.Serpa, JacintaDionísio, Francisco, 1971-Repositório da Universidade de LisboaMartins, Filipa Alexandra Dias2019-12-11T11:31:06Z201920192019-01-01T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/40477TID:202380556enginfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2023-11-08T16:39:47Zoai:repositorio.ul.pt:10451/40477Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T21:54:10.046178Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse
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