Heterotrophic microbial communities growing in marine plastic leachates: characterization using CARD-FISH and BONCAT techniques

• Autor(a) principal: Amorim, Stéphanie Birnstiel Falcão
• Data de Publicação: 2020
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: eng
• Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
• Texto Completo: http://hdl.handle.net/10400.1/16693
• topic: Poluição de plástico; Micróbios marinhos; Lixiviação de plástico; Cardfish; Boncat; Domínio/Área Científica::Ciências Naturais::Outras Ciências Naturais

Mais de 5 trilhões de peças de plástico estão presentes no oceano. Seus efeitos sobre os macroorganismos estão bem documentados e sabe-se que podem afetá-los principalmente devido à sua ingestão ou emaranhamento. No entanto, os estudos sobre seus efeitos em microrganismos são menos populares e focados, principalmente, na comunidade de biofilme que pode colonizar a superfície do plástico. Foi demonstrado que os plásticos marinhos são recobertos por matéria orgânica e inorgânica, seguida da colonização bacteriana, que é dominada por Gammaproteobacteria e Alphaproteobacteria, com a possibilidade de a bactéria Bacteroidetes aparecer mais tarde e se tornar abundante. Além disso, os plásticos geralmente contêm aditivos que são adicionados pela indústria para melhorar sua qualidade e desempenho. Esses aditivos e compostos, assim como os blocos monoméricos do plástico, podem ser liberados no meio aquático com consequências para a comunidade microbiana. Verificou-se que as bactérias marinhas absorvem os compostos orgânicos liberados pelo plástico, estimulando seu crescimento. No entanto, quais grupos de bactérias são capazes de usá-los e como isso os afeta ainda é desconhecido. Nossa hipótese é que os lixiviados plásticos podem alterar e afetar a composição e atividade da comunidade de bactérias heterotróficas marinhas quando expostas a diferentes condições ambientais e tipos de plástico. Portanto, o objetivo deste estudo foi caracterizar a comunidade bacteriana e avaliar sua atividade após a exposição aos compostos liberados por diferentes tipos de plásticos. O estudo testou lixiviados de diferentes tipos de plástico comumente encontrados no oceano, como polietileno de baixa densidade (PEBD) e poliestireno (PS), sob uma variedade de condições ambientais, como diferentes temperaturas (15 e 28 °C), exposição à radiação UV e ambiente escuro. Um plástico biodegradável, ácido polilático (PLA), também foi usado para comparar com os lixiviados termoplásticos. Na etapa de fotodegradação, peças plásticas foram adicionadas à água do mar artificial (AMA) em tubos de quartzo, para tratamentos de luz, e em frascos de borosilicato revestidos com folha de alumínio, para tratamentos de escuro. Um experimento comparou PEBD e PLA a 15 °C, enquanto o outro comparou PEBD e PS a 28 °C. As amostras foram incubadas durante 6 dias sob radiação ultravioleta e luz visível e temperatura constante. Na etapa de biodegradação, lixiviados plásticos obtidos no experimento de fotodegradação anterior foram utilizados após a remoção das peças de plástico. Os lixiviados foram inoculados com um inóculo bacteriano natural do Observatório Microbial de Blanes Bay (NO Mediterrâneo). Sua curva de crescimento foi acompanhada até atingirem a fase estacionária. Em seguida, 72 horas após a inoculação, a comunidade bacteriana que foi capaz de crescer nesses lixiviados plásticos foi caracterizada pelo uso das técnicas de hibridização in situ fluorescente de deposição de repórter catalisado (CARD-FISH) e marcação de aminoácidos não canônicos bioortogonal (BONCAT). CARD-FISH é um método que usa sondas oligonucleotídicas marcadas com peroxidase de rábano (HRP) e amplificação do sinal de tiramida, a fim de detectar células com baixo conteúdo ribossômico, que são frequentemente prevalentes em águas oligotróficas. O BONCAT é um método que tem sido usado para caracterizar a atividade de micróbios não cultivados, em seu ambiente de crescimento nativo. Esta abordagem semiquantitativa explora o estado fisiológico das bactérias marinhas, incubando uma amostra bacteriana com um análogo da metionina e usando a química do clique para identificar as células que incorporaram o substrato. Sondas diferentes foram usadas para avaliar a composição da comunidade, como GAM42a, que tem como alvo a maioria das Gammaproteobacterias, CF319a, que tem como alvo muitos membros do grupo Bacteroidetes, EUB338 I-II e –III, que tem como alvo a maioria das bactérias, e Alf968, que tem como alvo as Alphaproteobacterias. Suas abundâncias foram calculadas em relação às suas contribuições para a comunidade total, enquanto sua atividade foi avaliada pelo cálculo de seu valor médio cinza (VMC), que é a soma dos valores de cinza de todos os pixels na célula dividida pelo número de pixels. Um teste-t de Student bicaudal foi aplicado a fim de comparar a abundância e a atividade dos diferentes grupos filogenéticos bacterianos. Em ambas as temperaturas, as bactérias começaram a crescer após 24 horas e atingiram a fase exponencial após 72 horas de incubação. Ao final de ambos os experimentos, as amostras de plástico apresentaram maior abundância bacteriana do que os controles sem plástico, exceto para o PS irradiado. Todos os tipos de lixiviados plásticos levaram a uma composição de comunidade microbiana semelhante: elas eram compostas principalmente por Gamma-, Alphaproteobacteria e Bacteroidetes. Ambos os experimentos apresentaram contribuições semelhantes de cada grupo filogenético para a abundância total. Gamma- e Alphaproteobacteria mostraram ser os maiores contribuintes, enquanto Bacteroidetes foi o grupo menos abundante. Os lixiviados plásticos estimularam o crescimento de Gamma- e Alphaproteobacteria nos tratamentos plásticos em relação aos controles sem plásticos. No entanto, o impacto sobre os Bacteroidetes foi mais variável. A irradiação durante a lixiviação de plástico teve resultados contrastantes na abundância bacteriana que dependeu do tipo de plástico e do grupo filogenético. No entanto, lixiviados plásticos previamente irradiados, como os encontrados no oceano, estimularam a síntese de proteínas em bactérias marinhas em relação àquelas não expostas anteriormente à radiação. Portanto, algumas exceções foram capazes de mostrar como diferentes condições e tipos de plásticos podem ter impactos mistos em cada grupo filogenético e na comunidade bacteriana. Aqui também descobrimos que o plástico biodegradável, PLA, não liberou compostos biodegradáveis que se refletiram em um maior crescimento ou atividade bacteriana. Isso mostra que, na água do mar, o plástico biodegradável como o PLA, nem sempre é biodegradado e seu impacto sobre os microrganismos não difere dos demais termoplásticos. Este estudo foi o primeiro passo para entender como os lixiviados plásticos podem afetar a composição da comunidade microbiana na coluna d'água. Também identificou, pela primeira vez, quais grupos bacterianos são selecionados nos lixiviados plásticos marinhos e o quanto eles são ativos na síntese de proteínas. As sondas aqui utilizadas levaram a uma ampla identificação de microrganismos, em grupos filogenéticos, que incluem muitas espécies diferentes. Portanto, novos experimentos são necessários para identificar os organismos que compõem cada grupo e seu comportamento quando expostos aos lixiviados plásticos em diferentes condições, pois muitos fatores intrínsecos e extrínsecos podem ter diferentes efeitos isolados e combinados sobre as bactérias. Este estudo melhorou nosso conhecimento atual sobre a interação entre a lixiviação de plástico e micróbios marinhos e como isso pode afetar o ambiente, a teia alimentar e o sistema marinhos. Esses resultados fornecem insights cruciais sobre potenciais formas de biodegradação de plástico que podem ser desenvolvidas no futuro.