Disorder dynamic in cell: protein unfolding, molecular crowding and their combined action in intracellular aqueous two-phase systems formation

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Ribeiro, Sara da Silva
Data de Publicação: 2018
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: eng
Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
Texto Completo: http://hdl.handle.net/1822/77473
Resumo: Dissertação de mestrado em Bioquímica Aplicada, ramo Biotecnologia
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spelling Disorder dynamic in cell: protein unfolding, molecular crowding and their combined action in intracellular aqueous two-phase systems formationCiências Naturais::Outras Ciências NaturaisDissertação de mestrado em Bioquímica Aplicada, ramo BiotecnologiaInside the cell, the heterogeneous distribution of macromolecules can produce regions of different density, also known as membraneless organelles. These organelles are formed by phase separation, creating a specific microenvironment for the occurrence of localized biochemistry. The mechanism by which this phase separation occurs is still controversial, although various experimental evidences suggest a major role of intermolecular interactions between intrinsically disordered proteins (IDPs), proteins that display high structural flexibility crucial for this dynamic association. On the other hand, there is an increased evidence that globular proteins present high structural flexibility, where not only the native states but also the partially and globally unfolded states can have biological function. Accordingly, it is proposed that the intermolecular interactions between partial/globally unfolded states of globular proteins and other proteins could also lead to phase separation. The analysis of such hypothesis involved the in vitro mimicking of heat stress condition, a physiological situation that encompasses both the intracellular phase separation and thermal unfolding. To accomplish this, myoglobin was selected as a model to study the thermal unfolding and an in vitro model for phase separation was used, based on PEG/Dextran aqueous two-phase systems (ATPS). In addition, and to closer mimic the protein´s native environment, namely, the intracellular ions, KCl was added to the model. For comparative purposes, the effect of additional four different salts in the myoglobin stability (thermal and chemical) was evaluated. The analysis of the results for each salt suggests a thermal destabilization induced by Debye-Hückel screening, whereas in the case of chemical denaturation, the effects of salts followed their position in the Hofmeister series. Structural data from circular dichroism (CD) and fluorescence resonance energy transfer (FRET) analysis indicate a perturbation of the myoglobin structure both in the native and unfolded state, with the latter being distinct for thermal or chemical unfolding. The results regarding the proposal pointed out for an earlier phase separation of PEG/dextran systems above certain concentrations of myoglobin. The main reason for this effect emerges from the direct interactions between the myoglobin unfolded states and PEG, indicating that unfolded states of globular proteins can alter the behavior of phase separation, namely, by decreasing the concentration needed for its occurrence. Moreover, an additional contribution of the solvent was observed, suggesting that the interplay between the proteins and their surrounding water must be considered when studying the mechanism of intracellular phase separation. Collectively, the present results strengthen the proposed hypothesis, opening new biochemical perspectives for the occurrence of such phenomenon inside the cells.No interior da célula, a distribuição heterogénea de macromoléculas pode levar à formação de regiões com densidade diferente, designadas por organelos sem membrana. A formação destes organelos tem por base a separação de fases, criando microambientes específicos para a ocorrência de diversas reações bioquímicas. O mecanismo pelo qual esta separação de fases ocorre é controverso, apesar de várias evidências experimentais apontarem para uma relevância acrescida das interações intermoleculares entre proteínas intrinsecamente desordenadas. Estas proteínas possuem uma elevada flexibilidade estrutural, crucial para a sua associação dinâmica e consequente separação de fases. Por outro lado, estudos recentes indicam que as proteínas globulares apresentam elevada flexibilidade estrutural, onde, além dos estados nativos, também os estados parcial/totalmente desenroladas exibem função biológica. Deste modo, é proposto que interações intermoleculares entre estados parcialmente ou totalmente desenrolados de proteínas globulares com outras proteínas possam originar separação de fases. A analise desta hipótese baseou-se na mimetização in vitro de uma situação de stress térmico, uma vez que este ultimo envolve simultaneamente a ocorrência de separação de fases e o desenrolamento de proteínas. Para tal, a mioglobina foi selecionada como proteína modelo para estudar a desnaturação térmica e um modelo de separação de fases in vitro foi aplicado, baseado em sistemas de duas-fases aquosas PEG/Dextrano. Adicionalmente, e de modo a mimetizar mais fielmente o ambiente nativo das proteínas (nomeadamente, os sais intracelulares), KCl foi adicionado ao modelo. Para análise comparativa, o efeito de outros quatro sais na estabilidade térmica e química foi explorado. Os resultados do efeito individual de cada sal sugerem uma destabilização térmica da mioglobina devido a efeitos de Debye-Hückel screening enquanto, na desnaturação química, os sais influenciam a estabilidade da proteína de acordo com a posição dos mesmos na serie Hofmeister. Os resultados do efeito do desenrolamento das globulares proteínas na separação de fases indicam que esta ocorre para concentrações mais baixas de polímeros, com o aumento da concentração de mioglobina. Tal observação pode ser explicada com base nas interações adicionais entre o PEG e os estados desenrolados da mioglobina, apoiando deste modo, o envolvimento de estados desenrolados de proteínas globulares na separação de fases. Além disso, foi também observado um possível efeito adicional do solvente, sugerindo que as interações entre proteínas e as moléculas de agua nas proximidades devem ser consideradas quando se estuda o mecanismo molecular que leva a formação de separação de fases dentro da célula.The present work was performed in the Department of Chemistry, University of Minho, Braga, Portugal and founded by the Foundation for Science and Technology, FCT-Portugal, through direct financial support of Centre of Chemistry of University of Minho (CQUM) (projects UID/QUI/00686/2013 and UID/QUI/00686/2016).Marcos, João CarlosUniversidade do MinhoRibeiro, Sara da Silva20182018-01-01T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/1822/77473eng201955679info:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2023-07-21T12:15:11Zoai:repositorium.sdum.uminho.pt:1822/77473Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T19:07:37.481440Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse
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