Indirect resistance to antibiotics between bacteria of different species

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Costa, Pedro Fernando Rodrigues
Data de Publicação: 2022
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: eng
Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
Texto Completo: http://hdl.handle.net/10451/54261
Resumo: Tese de Mestrado em Biologia Molecular e Genética, Faculdade de Ciências, Universidade de Lisboa, 2022
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spelling Indirect resistance to antibiotics between bacteria of different speciesResistência indirectaCross-feedingBactériaCo-existênciaExclusão competitivaTeses de mestrado - 2022Domínio/Área Científica::Ciências Naturais::Ciências BiológicasTese de Mestrado em Biologia Molecular e Genética, Faculdade de Ciências, Universidade de Lisboa, 2022Indirect resistance (IR) is a well documented polymicrobial interaction, defined as the protection of an antibiotic-sensitive strain by a neighboring resistant strain through the detoxification of the surrounding environment. It is typically observed as a consequence of antibiotic-based treatments, with a notable proclivity for β-lactam antibiotics. The large majority of IR occurrences involve cohabiting strains of diverging species. By comparison, examples of intra-species IR remain scarce. To explain this discrepancy, we propose that resource competition can counteract IR by rendering intra-species strain coexistence untenable. Likewise, inter-species IR can occur unimpeded as different strains can coexist by occuppying different metabolic niches, or even share metabolic by-products through cross-feeding. To test this hypothesis, we performed intra- and inter-species co-cultures of resistant and sensitive strains, in ampicillin-supplemented minimal media with competing and non-competing carbon sources. Also, cross-feeding was evaluated by performing co-cultures in media supplemented with carbon sources only consumable by one of the strains. While intra-species competition was invariable, interspecies competition was conditional of the carbon source. We found that sensitive strains exhibited significant growth reduction in intra-species co-culturing compared to when in mono-culture. By contrast, when paired with a resistant strain belonging to a different species, sensitive strains were able to match the growth observed in mono-culture. Co-cultures also showed potential cross-feeding interactions allowing the growth of both resistant and sensitive strains in the absence of their specific carbon source. Our results show that IR may be optimized in the absence of strain competition, which could potentially explain the lack of observable intra-species IR when compared to inter-species. Furthermore, we identified that cross-feeding mechanisms between strains might strenghten the cooperative nature of IR by permiting the growth of the resistant cells. Conversely, it may also extend the exploitation of the resistant strain to include metabolic nutrients in addition to antibiotic-disabling enzymes.A resistência indireta (RI), também conhecida como patogenicidade indireta, define-se como a proteção de uma estirpe sensível por uma estirpe resistente vizinha contra determinado antibiótico através da desintoxicação do ambiente circundante. Tem sido observada na clínica hospitalar tipicamente como consequência de tratamentos com antibióticos, revelando uma tendência notável para antibióticos βlactâmicos. Para tal, contribui o facto de que as enzimas β-lactamases (principal defesa contra βlactâmicos) são normalmente alvo de transporte para o meio extracelular. Este mecanismo de acção favorece fortemente a RI, pois permite que estas enzimas circulem livremente desintoxicando o meio, em igual benefício tanto para as estirpes produtoras de β-lactamases (resistentes) como para as estirpes não-produtoras (sensíveis). De facto, qualquer molécula que seja transportada para o espaço extracelular, poderá em teoria contribuir para uma interação deste género. Um caso semelhante será o efeito de cross-feeding, outra interação polimicrobiana que se define como a partilha (passiva ou activa) de produtos metabólicos entre estirpes, tipicamente pertencentes a espécies diferentes. Neste caso, uma espécie poderá produzir um metabolito secundário, posteriormente transportado para o espaço extracelular, que irá ser consumido por espécies vizinhas não-produtoras. Esta partilha poderá também ser recíproca, sendo que duas ou mais estirpes diferentes poderão sintetizar diferentes produtos metabólicos e partilhá-los entre si, estabelecendo-se assim um equílibrio entre as várias populações e promovendo-se a biodiversidade. Apesar da importância deste tipo de interações para o estudo de comunidades bacterianas, a RI permanece um tópico largamente subvalorizado e pouco compreendido. Uma das questões mais notáveis sobre a ocorrência de RI na Natureza será a diferença observada entre a frequência de RI em situações de colonização inter-espécies e situações intra-espécies. A grande maioria das ocorrências de RI normalmente envolvem estirpes bacterianas co-habitantes de espécies diferentes. No entanto, casos de RI entre estirpes pertencentes à mesma espécie estão raramente documentados na literatura. Ao longo dos anos, pouco tem sido feito para elucidar a(s) causas(s) desta discrepância. No âmbito deste projecto, propomos que a competição por fontes de carbono poderá desfavorecer a RI, tornando a co-existência de estirpes da mesma espécie insustentável. Pela mesma lógica, a RI interespécies pode ocorrer com maior propensão, pois diferentes estirpes podem co-existir ocupando diferentes nichos metabólicos ou mesmo compartilhando subprodutos metabólicos por cross-feeding. Para testar esta hipótese, realizámos co-culturas de estirpes resistentes e sensíveis, sendo elas da mesma espécie ou não, em meio mínimo suplementado com o antibiótico ampicilina (um β-lactâmico) e com fontes de carbono comuns ou exclusivas a cada estirpe. Para tal, construíram-se quatro estirpes, duas estirpes E. coli resistente e sensível, e duas estirpes S. enterica resistente e sensível. Como fontes de carbono, utilizou-se glucose, lactose e citrato. Aqui, a glucose funciona como fonte consumível por ambas as espécies, enquanto que a lactose e o citrato são exclusivas às estirpes E. coli e S. enterica, respectivamente. A lactose e o citrato, foram utilizados em combinação para gerar co-culturas com estirpes pertencentes a espécies diferentes em ausência de competição. Em co-culturas em que a fonte de carbono seja consumível pelas duas estirpes, espera-se que a subsequente competição pelas mesmas dificulte o crescimento das estirpes sensíveis, mesmo após a inactivação do antibiótico no meio. Especificamente, será de esperar que enquanto o meio não esteja suficientemente desintoxicado, a estirpe resistente tenha acesso exclusivo à fonte de carbono, deixando pouco da mesma disponível para sustentar o posterior crescimento da sensível. Deste modo, prevê-se que a estirpe sensível não tenha carbono suficiente para atingir a sua taxa de crescimento e concentração máximas. Por outro lado, em meios suplementadas com fontes de carbono exclusivas às estirpes sensível e resistente, espera-se que a resistente consuma exclusivamente a sua fonte enquanto inactiva a ampicilina circundante. Após a desintoxicação do meio, a estirpe sensível ainda terá acesso à sua fonte de carbono e conseguirá atingir a sua taxa de crescimento e concentração final máximas. Adicionalmente, procurámos avaliar qualitativamente a ocorrência de cross-feeding realizando co-culturas em meios suplementados com fontes de carbono apenas consumíveis pelas estirpes sensíveis. O crescimento bem-sucedido das sensíveis implica a ocorrência de interações de cross-feeding que favoreçam a proliferação limitada da estirpe resistente e a subsequente desintoxicação do meio. Inicialmente, realizámos mono-culturas das estirpes resistentes de E. coli e S. enterica em lactose e citrato. Enquanto que a estirpe E. coli mostrou o comportamento previsto, crescendo em lactose e permanecendo estacionária em citrato, S. enterica revelou resultados mais inesperados. De facto, a estirpe S. enterica mostrou um crescimento limitado na presença de lactose, para além do crescimento previsto em citrato. Como a metabolização de lactose não é uma característica típica da S. enterica, inoculámos a mesma em meio M9 sem qualquer fonte de carbono para confirmar se de facto a sua proliferação estaria a ser suportada pela lactose. Verificou-se que, mesmo na ausência total de fonte de carbono, a estirpe S. enterica resistente continuou a revelar crescimento. Propomos que esta proliferação seja devida a potenciais mecanismos de armazenamento de carbono (por exemplo, síntese de glicogénio), que permitam produzir e armazenar moléculas de carbono durante a sua cultura overnight. Esta capacidade foi tomada em conta durante a análise das várias co-culturas inter- e intra-espécies efectuadas ao longo do trabalho. Enquanto que competição intra-espécies se verificou em todas as fontes de carbono testadas, a ocorrência de competição inter-espécies era totalmente dependente da fonte de carbono utilizada no meio. Nomeadamente, estirpes sensíveis exibiram reduções significativas nas suas concentrações finais (em comparação com mono-culturas) quando cultivadas em co-cultura com estirpes resistentes da mesma espécie. Isto verificou-se tanto para estirpes E. coli em meio M9 com lactose, como para estirpes S. enterica em M9 com citrato. De modo a comprovar que esta redução no crescimento das estirpes sensíveis ocorreu devido à competição metabólica com as resistentes, fizeramse também co-culturas com estirpes de espécies diferentes em meio M9 suplementado com glucose. Observámos que enquanto que a estirpe E. coli sensível sofreu uma redução no seu crescimento quando posta em co-cultura com S. enterica resistente, o mesmo não aconteceu com as estirpes S. enterica sensível e E. coli resistente. Uma possível explicação será a capacidade de armazenamento de carbono por parte da S. enterica, previamente observada quando a mesma foi posta em meio M9 sem fonte de carbono. Este mecanismo poderá ter permitido às estirpes S. enterica suportar o seu crescimento face à exaustão da glucose no meio. Outra razão poderá também ter sido o facto da E. coli ter tendência a diminuir acentuadamente em concentração no início de cada cultura. Possivelmente esta redução terá anulado a vantagem em concentração inicialmente usufruída pela E. coli resistente, adiando a exaustão da glucose em relação à desintoxicação do meio. Por outro lado, quando estirpes pertencentes a espécies diferentes foram postas em co-cultura em meio M9 suplementado por ambos lactose e citrato, as estirpes sensíveis foram sempre capazes de alcançar a concentração máxima observada em monocultura. Isto fortalece a hipótese de que na ausência de competição nutricional, as estirpes sensíveis podem beneficiar da RI sem qualquer decréscimo no seu fitness. Potenciais interações de cross-feeding foram também observadas ao longo das co-culturas interespécies, permitindo o crescimento de estirpes resistentes e sensíveis na ausência da sua fonte de carbono específica. Quando a estirpe S. enterica sensível foi cultivada em co-cultura com a estirpe E. coli resistente em meio M9 com citrato, observámos que E. coli conseguiu proliferar o suficiente para desintoxicar o meio e permitir o crescimento da S. enterica. Em conformidade, quando E. coli era a estirpe sensível, esta também revelou proliferação limitada mesmo quando em co-cultura em M9 complementado com citrato. É de notar que quando a estirpe E. coli resistente foi cultivada em monocultura em meio M9 com citrato, esta não revelou qualquer proliferação, e o mesmo aconteceu quando duas estirpes E. coli (resistente e sensível) foram co-cultivadas em citrato. Dado que o crescimento da E. coli em citrato só foi observado quando em co-cultura com S. enterica, podemos inferir que o crossfeeding pela S. enterica na ausência de uma fonte de carbono metabolizável pela E. coli terá suportado o crescimento da mesma. No entanto, não foi possível observar cross-feeding entre as estirpes E. coli resistente e S. enterica sensível, uma vez que devido aos mecanismos de armazenamento de carbono previamente mencionados, o crescimento da S. enterica em M9 com lactose foi sempre independente de estar em mono- ou co-cultura. Os nossos resultados mostram que a RI pode ser otimizada na ausência de competição por fonte de carbono, o que ajuda a explicar a escassez de casos de RI intra-espécies observados em comparação com inter-espécies. Além disso, identificámos que mecanismos de cross-feeding entre estirpes podem fortalecer a natureza cooperativa da RI, sustentando o crescimento das células resistentes. Por outro lado, pode também proporcionar uma relação parasítica entre estirpes, sendo que estirpes sensíveis poderão tirar proveito não só de enzimas inactivadoras de antibióticos produzidas pelas resistentes, como também de quaisquer nutrientes metabólicos libertados pelas mesmas.Monteiro, FranciscaDionísio, FranciscoRepositório da Universidade de LisboaCosta, Pedro Fernando Rodrigues202220222025-04-30T00:00:00Z2022-01-01T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/54261enginfo:eu-repo/semantics/embargoedAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2023-11-08T17:00:41Zoai:repositorio.ul.pt:10451/54261Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T22:05:10.394140Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse
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