Caracterização Bioquímica e Biofísica de proteínas de armazenamento de Cobre

• Autor(a) principal: Cruz, João Miguel Oliveira dos Santos
• Data de Publicação: 2020
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
• Texto Completo: http://hdl.handle.net/10362/111050
• topic: Proteínas de armazenamento de cobre; Deinococcus grandis; Domínio/Área Científica::Engenharia e Tecnologia::Outras Engenharias e Tecnologias

As recém-descobertas proteínas de armazenamento de cobre (Csps), presentes em procariotas, têm uma função de armazenamento de cobre, podendo também apresentar funções de defesa. Esta tese foca-se na caracterização de duas Csps de Deinococcus grandis. Inicia-se com a identificação e análise bioinformática das duas proteínas a estudar, a DgrCspA e a DgrCspB. Foram obtidos modelos estruturais e são semelhantes às estruturas cristalográficas publicadas de outras Csps. A expressão e purificação de ambas as proteínas recombinantes tem um rendimento de 15-20 mg de proteína por litro de cultura com uma pureza de >90%. Os dados obtidos demonstram que a DgrCspA e a DgrCspB diferem em conteúdo de hélices-α, com 97% e 80%, respetivamente. Na presença de cobre, estes valores decrescem para 80% e 67%. A elevadas temperaturas, o conteúdo em hélice-α desce para 83% na DgrCspA e para 48% na DgrCspB, e com a adição de cobre estas passam a apresentar 4% de hélice-α. Ainda, a absorvância das amostras desce progressivamente após os 40 ºC, o que poderá indicar agregação. Ensaios de ligação de cobre à DgrCspA mostram um aumento de absorvância a 315 nm com o aumento de cobre. Em condições aeróbias, o aumento é observado até cerca de 16 iões de cobre por monómero. Na presença de um quelante de cobre, é observada a ligação de apenas 4 equivalentes de cobre. Anaerobicamente, estes valores sobem para 18-20 iões de cobre. A adição de Cu(II) demonstrou causar a agregação de DgrCspA. Devido à ausência de resíduos aromáticos nestas proteínas, houve a necessidade de desenvolver novos métodos de quantificação. A aplicação de FTIR permitiu a quantificação das DgrCsps e outras proteínas, com um erro entre 1 e 6%. Contrariamente aos métodos convencionais, a presença de alguns aditivos não teve qualquer efeito na quantificação.