Aspergillus isolados em diferentes contextos indoor e ocupacionais: sua potencial relevância para a saúde
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| Data de Publicação: | 2018 |
| Tipo de documento: | Dissertação |
| Idioma: | por |
| Título da fonte: | Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) |
| Texto Completo: | http://hdl.handle.net/10451/36679 |
Resumo: | Tese de mestrado em Biologia Humana e Ambiente, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, em 2018 |
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Aspergillus isolados em diferentes contextos indoor e ocupacionais: sua potencial relevância para a saúdeAspergillusSaúde ocupacionalAr interiorExposição a fungosResistência a azóisPesquisa de mutaçõesA. fumigatusTeses de mestrado - 2018Domínio/Área Científica::Ciências Naturais::Ciências BiológicasTese de mestrado em Biologia Humana e Ambiente, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, em 2018Introdução: A exposição a elevadas concentrações de conídios fúngicos, nomeadamente do género Aspergillus, constitui um potencial fator de risco para o desenvolvimento de sintomas respiratórios em contextos ocupacionais e não-ocupacionais. Aspergillus fumigatus tem conídios de pequenas dimensões, com elevada capacidade de aerossolização e dispersão, sendo o principal agente responsável por aspergiloses brocopulmonares alérgicas, crónicas e invasivas. O seu elevado número de divisões mitóticas gera uma variada gama de mutações espontâneas que na presença de azóis pode originar estirpes com mutações que conferem resistência a estes antifúngicos. Na medicina, os azóis mais utilizados são os triazóis itraconazol, voriconazol e posaconazol, molecular e estruturalmente semelhantes aos fungicidas agrícolas propiconazol, tebuconazol, difenoconazol, epoxiconazol e bromuconazol, presentes em 60,9% dos fungicidas azóis permitidos em Portugal. Os ambientes interiores ocupacionais e não-ocupacionais podem ser ricos em elevadas concentrações de esporos e determinadas espécies de Aspergillus que podem eventualmente causar riscos respiratórios aos seus ocupantes. Os trabalhadores agrícolas estão expostos a grandes concentrações de bioaerossóis e, consequentemente, a maiores concentrações de microrganismos em suspensão no ar, apresentando uma maior prevalência de sintomas respiratórios comparativamente a habitantes urbanos. As estufas são ambientes com características microclimáticas ótimas para a formação de bioaerossóis, para o crescimento de fungos e seleção de isolados resistentes, aumentando o risco de desenvolvimento de sintomas respiratórios dos trabalhadores. Objetivos: Este estudo teve como objetivo conhecer a epidemiologia molecular das espécies de Aspergillus em diferentes contextos ocupacionais e não-ocupacionais e os padrões de suscetibilidade dos isolados de A. fumigatus. Foi ainda estudada a exposição a fungos em trabalhadores agrícolas (nomeadamente no ambiente específico das estufas). Por último, foi otimizada (e aplicada a isolados laboratoriais) uma metodologia para pesquisa de mutações no gene Cyp51A e seu promotor, em Aspergillus fumigatus. Materiais e Métodos: Foi feita uma amostragem do ar interior em estufas agrícolas e no exterior das estufas pelo método de sedimentação em placa. Os 19 isolados de Aspergillus provenientes das colheitas ambientais, 60 estirpes de Aspergillus ambientais recebidas do exterior e 5 estirpes de referência foram identificados por biologia molecular com recurso à sequenciação dos genes β-tubulina e calmodulina. A suscetibilidade de todos os isolados A. fumigatus foi testada por meios de screening com itraconazol (4μg/ml), voriconazol (1 ou 4μg/ml) e posaconazol (0,5μg/ml), com confirmação de falsos positivos por teste de suscetibilidade de difusão em gradiente. Foi otimizada a técnica de PCR e sequenciação do gene Cyp51A e do respetivo promotor, testando diferentes condições de forma a obter os melhores resultados de amplificação de A. fumigatus sensu stricto e com a máxima especificidade. A pesquisa de mutações no gene Cyp51A e seu promotor foi efetuada utilizando as reações otimizadas aplicadas às 5 estirpes de referência e 1 A. fumigatus isolado nas colheitas ambientais. Resultados: Os fungos que foram encontrados em maior quantidade e mais frequentemente em contexto agrícola pertencem aos géneros Cladosporium e Aspergillus. Foi encontrada uma maior diversidade e quantidade de esporos fúngicos em estufa do que no exterior, sendo a diferença entre o interior e o exterior estatisticamente significativa. As culturas de plantas aromáticas parecem estar associadas a uma maior exposição a esporos fúngicos. Foram também encontradas diferenças significativas relativamente à diversidade de géneros fúngicos consoante a cultura ou atividade em questão, nomeadamente a associação de Aspergillus spp., à apanha de alface. No que respeita aos outros ambientes ocupacionais estudados, ressalvam-se os trabalhadores da indústria de resíduos que se verificou estarem expostos principalmente a A. tubingensis enquanto a espécie de Aspergillus mais frequentemente encontrada nos restantes contextos foi A. fumigatus. Não foram encontradas resistências aos azóis testados. Conclusão: O estudo da epidemiologia molecular de Aspergillus isolados de diferentes contextos ocupacionais e não-ocupacionais permitiu encontrar um elevado número de espécies de Aspergillus. Nenhum dos isolados A. fumigatus apresentou resistência aos azóis clínicos testados. Os trabalhadores agrícolas quando desenvolvem as suas atividades no interior das estufas estão expostos a uma maior diversidade e quantidade de fungos, incluindo Aspergillus, do que no exterior. Nos ambientes estudados a espécie de Aspergillus mais frequentemente encontrada foi Aspergillus fumigatus, o que potencialmente aumenta o risco dos seus ocupantes desenvolverem sintomas respiratórios. Os agricultores e os trabalhadores da indústria de resíduos estão expostos principalmente a espécies crípticas do género Aspergillus. A otimização da metodologia para pesquisa de mutações no gene Cyp51A e no seu promotor de estirpes Aspergillus fumigatus sensu stricto permitiu detetar todas as mutações das estirpes resistentes utilizadas (com mutações conhecidas) e a sua aplicação numa estirpe ambiental, proveniente das recolhas ambientais no interior das estufas, resultou numa deteção bem-sucedida de mutações, não tendo sido encontradas, no entanto, mutações que conferem resistência.Introduction: Exposure to high concentrations of fungal conidia, mainly of Aspergillus, constitutes a potential risk to develop respiratory symptoms in occupational and non-occupational settings. Aspergillus fumigatus has small conidia with high airborne dispersion ability. Thus, this species is the main agent of allergic bronchopulmonary, chronic and invasive aspergillosis. In the presence of azoles, the high number of mitotic divisions can originate strains with azole-resistance mutations. In medicine the most common used azoles are itraconazole, voriconazole and posaconazole. Agricultural fungicides as propiconazole, tebuconazole, difenoconazole, epoxiconazole and bromuconazole are molecular and structurally similar to medical azoles. These fungicides are present in 60.9% of all allowed agricultural azoles in Portugal. Occupational and non-occupational environments can have high counts of spores and some Aspergillus species can eventually cause respiratory risks to people who are exposed to them. Farmers are exposed to higher concentrations of bioaerosols and to larger amounts of airborne microorganisms than urban inhabitants are. Greenhouses are environments with microclimatic characteristics favorable to high concentrations of bioaerosols, growth of fungi and selection of resistant strains, increasing the risk of farmers in developing respiratory symptoms. Aim: The goal of this study was to understand the molecular epidemiology of Aspergillus species in different occupational and non-occupational settings, and susceptibility patterns of A. fumigatus strains. Study farmers’ exposure to fungi. The optimization of a methodology able to detect mutations in Cyp51A gene and in its promoter (in A. fumigatus sensu stricto) was done and applied to laboratory isolates. Materials and methods: Air sampling was made from greenhouses and their outdoor by the sedimentation plate method. Nineteen Aspergillus were collected from the referred setting. These ones, together with 60 environmental Aspergillus from other sources received in the laboratory and 5 reference strains were identified by molecular biology by sequencing the β-tubulin and calmodulin genes. A. fumigatus susceptibility was tested using screening media supplemented with itraconazole (4μg/ml), voriconazole (1 or 4μg/ml) and posaconazole (0.5μg/ml). False positives were confirmed using an agar-based gradient test. PCR and sequencing methods of Cyp51A gene and its promoter were optimized. Detection of mutations in Cyp51A gene and its promoter was done using the previously optimized reactions and applied to 5 reference strains and 1 A. fumigatus collected in environmental sampling. Results: The most prevalent fungi found in agricultural context belong to the Cladosporium and Aspergillus genera. The diversity and amount of fungal conidia was significantly greater in greenhouses than outdoor. Aromatic plant crops appear to be associated with an increased exposure to fungal spores. Significant differences were also found in the diversity of fungal genera, depending on the crops or activities performed. Regarding the other occupational environments studied, we lay emphasis on the waste industry workers who are mainly exposed to A. tubingensis. In the other occupational environments and in houses the most frequently species found was A. fumigatus. None of the tested isolates belonging to Fumigati section showed resistance to the tested azoles. Conclusion: The epidemiological study of the Aspergillus found in different occupational and non-occupational environments allowed identifying a high number of Aspergillus species. None of the A. fumigatus isolates was resistant to azoles. Farmers working inside greenhouses are exposed to a higher diversity and amount of fungal conidia (including Aspergillus spp.) than the workers working outside the greenhouses. The occupational and non-occupational environments studied showed that people inside these environments are mainly exposed to A. fumigatus, which may increase the risk of developing respiratory symptoms. Farmers and waste industry workers are mainly exposed to Aspergillus cryptic species. The optimization of the methodology for search mutations in Cyp51A gene and its promoter in Aspergillus fumigatus sensu stricto strains allowed the detection of all the mutations from resistant strains with previously known mutations. The application of this method resulted in a successful detection of mutations from a strain collected in the greenhouse air, but the mutations that confer resistance were not found in this isolate.Sabino, Raquel Filipa PinheiroDias, Deodália Maria Antunes,1952-Repositório da Universidade de LisboaSimões, Daniela Sofia Custódio2021-12-20T01:30:17Z201820182018-01-01T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/36679TID:202192059porinfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2023-11-08T16:33:24Zoai:repositorio.ul.pt:10451/36679Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T21:50:53.307912Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse |
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