InCited2 secrete cardiogenic molecules
Autor(a) principal: | |
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Data de Publicação: | 2020 |
Tipo de documento: | Dissertação |
Idioma: | eng |
Título da fonte: | Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) |
Texto Completo: | http://hdl.handle.net/10400.1/15097 |
Resumo: | The CBP/p300 interacting transactivator with Glu/Asp rich carboxy-terminal domain 2 (Cited2) interacts with many CBP/p300-dependent transcriptional factors. Cited2 plays an important role in cardiac development in humans and mouse. Furthermore, in vitro studies using embryonic stem cells (ESC) have demonstrated its importance for their specification into cardiac cell lineages. Moreover, the WNT5a and WNT11 were identified and overexpressed in the conditioned medium of ESC overexpressing CITED2 (CM-CITED2) and showed to hold the potential to rescue cardiogenic defects caused by Cited2 depletion in vitro and in zebrafish embryos. We believe that more secreted proteins which may be influenced by CITED2 expression may also have the potential to rescue the cardiogenic defects caused by Cited2 depletion. Amongst these potential candidate proteins FGF10 was identified in a preliminary study but was not validated for its capacity to reverse cardiac defects in zebrafish triggered by Cited2 depletion. Here, we have assessed the capacity of FGF10 to rescue defects caused by Cited2 depletion in zebrafish. Although, we were not able to definitively conclude about FGF10’s ability to rescue defects caused by Cited2 depletion due to a possible degradation of the morpholinos (MO) used to inhibit Cited2 expression, we obtained some promising preliminary results. In order to identify other candidate proteins that may be present in the secretome of CITED2 overexpressing cells, we have used Mass Spectrometry analysis to further determine the content of CM-CITED2 and control medium (CM-control). Interestingly, we identified a differential composition of proteins in the conditioned media, and amongst these proteins, some have been described to be associated with cardiomyocyte’s development. The analysis of transcripts expression of genes encoding relevant proteins suggested that these proteins may be expressed at critical cardiogenic steps. Overall, this work demonstrates that overexpression of CITED2 may promote the early onset expression of genes normally expressed in cardiac differentiated cells. And though we were not able to conclude about FGF10 ability to rescue Cited2 deficiency, we identified other secreted proteins that may as well hold a potential for the development of therapies |
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InCited2 secrete cardiogenic moleculesCITED2FGF10SecretomaEfeitos cardíacosCélulas estaminais embrionáriasZebrafishDomínio/Área Científica::Ciências Médicas::Outras Ciências MédicasThe CBP/p300 interacting transactivator with Glu/Asp rich carboxy-terminal domain 2 (Cited2) interacts with many CBP/p300-dependent transcriptional factors. Cited2 plays an important role in cardiac development in humans and mouse. Furthermore, in vitro studies using embryonic stem cells (ESC) have demonstrated its importance for their specification into cardiac cell lineages. Moreover, the WNT5a and WNT11 were identified and overexpressed in the conditioned medium of ESC overexpressing CITED2 (CM-CITED2) and showed to hold the potential to rescue cardiogenic defects caused by Cited2 depletion in vitro and in zebrafish embryos. We believe that more secreted proteins which may be influenced by CITED2 expression may also have the potential to rescue the cardiogenic defects caused by Cited2 depletion. Amongst these potential candidate proteins FGF10 was identified in a preliminary study but was not validated for its capacity to reverse cardiac defects in zebrafish triggered by Cited2 depletion. Here, we have assessed the capacity of FGF10 to rescue defects caused by Cited2 depletion in zebrafish. Although, we were not able to definitively conclude about FGF10’s ability to rescue defects caused by Cited2 depletion due to a possible degradation of the morpholinos (MO) used to inhibit Cited2 expression, we obtained some promising preliminary results. In order to identify other candidate proteins that may be present in the secretome of CITED2 overexpressing cells, we have used Mass Spectrometry analysis to further determine the content of CM-CITED2 and control medium (CM-control). Interestingly, we identified a differential composition of proteins in the conditioned media, and amongst these proteins, some have been described to be associated with cardiomyocyte’s development. The analysis of transcripts expression of genes encoding relevant proteins suggested that these proteins may be expressed at critical cardiogenic steps. Overall, this work demonstrates that overexpression of CITED2 may promote the early onset expression of genes normally expressed in cardiac differentiated cells. And though we were not able to conclude about FGF10 ability to rescue Cited2 deficiency, we identified other secreted proteins that may as well hold a potential for the development of therapiesO coração apesar de ser o primeiro órgão a ser desenvolvido, é de extrema complexidade, incluindo cardiomiócitos, progenitores cardíacos, células endoteliais, fibroblastos, células vasculares do músculo liso, células neuronais, células do sistema imune, entre outras. Deste modo, a comunicação intracardíaca é essencial para manter a adequada função cardíaca, integridade e homeostasia. De facto, as células libertam para o meio extracelulares diversos fatores solúveis e vesículas extracelulares (EV) de forma a permitir a comunicação inter- e intracelular. As doenças congénitas cardíacas (CHD) são caracterizadas por malformações no coração, provocando defeitos nas paredes, válvulas e/ou vasos sanguíneos. Aproximadamente 1% das crianças nascem com CHD sendo que uma grande percentagem irá ser submetida a cirurgia antes de completar 1 ano de vida. Para alem disso, os desenvolvimentos de tratamento e suporte médico ao longo dos anos, levaram ao aumento da sobrevivência e consequente prevalência das CHD. No entanto, apesar do aumento do conhecimento científico no que diz respeito ao desenvolvimento cardíaco, a sua complexidade dificulta a identificação de alvos e mecanismos moleculares inerentes às CHD. O desenvolvimento cardíaco é controlado por uma complexa rede de vias metabólicas, desde a via NODAL/ACTIVINA, WNTS, NOTCH, FGFs, entre outras, que, por sua vez irão regular a cardiogénese a partir de fatores de transcrição como o MESP1, NKX2.5, ISL1 e TBX. Tendo em conta o impacto destas vias, já foram estudados o impacto de mutações pontuais em genes das vias mencionadas. De facto, essas mesmas mutações pontuais são responsáveis, de forma independente, de cerca de 10% das CHD, no entanto, na maioria dos casos ainda não se conhece a causa da doença. Neste sentido, de forma a melhorar o conhecimento de melhores métodos de diagnóstico e tratamento das CHD, é crucial descobrir fatores extra-genómicos críticos para o desenvolvimento cardíaco. CITED2 é um fator de transcrição com alta afinidade para o domínio 1 rico em Cisteínas-Histidinas (domínio CH1) da p300/CBP. No entanto, não se liga diretamente ao DNA, sendo que atua como co-ativador ou co-inibidor de outros fatores de transcrição dependentes de p300/CBP. O domínio do terminal carboxil de proteínas da família CITED (CR2) é um domínio que tem alta afinidade com o domínio CH1 da p300/CBP. Desde 2005, que foram descobertas diversas mutações relevantes no gene Cited2 em pacientes com CHD. Deste modo, os defeitos cardíacos mais associados ao CITED2 são: VSD, ASD, TOF e a TGA. No entanto, a maioria das variantes mutantes de CITED2 identificadas em pacientes com CHD afetavam apenas marginalmente a sua atividade biológica mais conhecida como repressor do HIF-1α e co ativador de TFAP2C ex vivo. Para além do papel crucial de CITED2 como regulador de fatores de transcrição dependentes de p300/CBP, foi mostrado no nosso laboratório que também induz a secreção de diversas proteínas que facultam a comunicação intra- e intercelular. De facto, foi mostrado que o meio condicionado obtido de células com sobre expressão de Cited2 conseguem reverter os defeitos da depleção de Cited2 in vitro num modelo de mESC. Para além disso, com recurso à tecnologia de microarrays, foi possível identificar diversos genes cujas proteínas estavam descritas como proteínas que são secretadas e cuja expressão estava alterada em células com a sub expressão de Cited2. Desta forma foram identificados diversos genes que poderiam estar dependentes da expressão de Cited2, sendo WNT11 e WNT5a foram as proteínas que para além da sua expressão génica acompar a expressão de Cited2, foram suficientes para recuperar os defeitos cardíacos induzidos pela depleção de Cited2 tanto in vitro (com mESC) como in vivo (com um modelo de Danio rerio). No entanto, tal como referido, mais candidatos foram identificados. De facto, a expressão de Fgf10 também acompanhava a expressão de Cited2, tanto na análise de microarrays como posteriormente por qPCR em mESC sobre expressando ou depletando Cited2. Para além disso, quando FGF10 foi imunodepletado do meio condicionado obtido a partir de mESC sobre expressando Cited2, o mesmo meio condicionado deixou de conseguir reverter os defeitos cardíacos induzidos pela depleção de Cited2, exercendo um fenótipo pior do que o controlo. Desta forma, para efeitos da presente tese, foi estudado se FGF10 consegue reverter os defeitos cardíacos induzidos pela depleção de Cited2, num modelo in vivo. Para este efeito, foi usado um modelo in vivo préviamente validado no nosso laboratório com recurso ao peixe-zebra e a uma solução de morpholinos (MO) para depletar Cited2. No entanto, não conseguimos obter a mesma uma percentagem tão alta de defeitos cardíacos induzidos e morte com os Mos como previamente. Como tal, foi indagada a possibilidade de os MOs estarem degradados sendo que quando se repetiu o ensaio in vivo, mas com uma concentração 3x superior de MOs, foi observado um aumento dos defeitos e morte. No entanto, aquando da combinação de CITED2 com os MOs, apenas houve uma redução dos defeitos e morde induzidas. Desta forma, poder-se-á deduzir que haverá uma elevada probabilidade de os oligos dos MOs estarem degradados e de os defeitos e morte induzidos serem também de off-targets devido à presença de fragmentos dos oligos dos MOs. No entanto, foi possível observar que FGF10 teve um efeito parcial de reverter alguns defeitos e morte sendo que poderá ter um potencial para reverter os defeitos cardíacos induzidos pela depleção de Cited2. De forma a identificar outros candidatos que estão presentes no secretoma, recorremos ao LC-MS do meio condicionado de mESC sobre expressando Cited2 e do respetivo controlo. Desta forma foi possível identificar proteínas envolvidas no desenvolvimento cardíaco, mais precisamente em cardiomiócitos. No entanto, essas proteínas correlacionadas com os cardiomiócitos estão descritas como responsáveis pela remodelação da matriz extracelular (ECM). No entanto, a meta-análise dos respetivos candidatos diferencialmente representados no secretoma analisado, sugeriu a presença de proteínas expressas em momentos críticos para a cardiogénese. Em suma, o presente trabalho demonstrou que a sobre expressão de Cited2 pode promover a expressão precoce de genes expressos em células cardíacas diferenciadas. E, apesar de não termos dados suficientes para concluir que FGF10 consegue reverter os efeitos da depleção de Cited2, fomos capazes de identificar outras proteínas secretadas com potencial para desenvolver novas abordagens terapêuticas.Bragança, JoséSapientiaLopes, João André Pereira2023-05-04T00:30:14Z2020-05-042020-05-04T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10400.1/15097TID:202496694enginfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2023-07-24T10:27:29Zoai:sapientia.ualg.pt:10400.1/15097Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T20:06:00.180535Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse |
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