Caracterização dos domínios da proteína adaptadora Ezrina essenciais à estabilização membranar do canal CFTR-F508del
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| Data de Publicação: | 2017 |
| Tipo de documento: | Dissertação |
| Idioma: | por |
| Título da fonte: | Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) |
| Texto Completo: | http://hdl.handle.net/10451/31986 |
Resumo: | Tese de mestrado em Bioquímica, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2017 |
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Caracterização dos domínios da proteína adaptadora Ezrina essenciais à estabilização membranar do canal CFTR-F508delFibrose quísticaCFTR-F508delVX-809EzrinaPéptidos bioativosTeses de mestrado - 2017Domínio/Área Científica::Ciências Naturais::Ciências QuímicasTese de mestrado em Bioquímica, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2017A Fibrose Quística (FQ) é a doença genética autossómica recessiva mais prevalente em Caucasianos. Esta doença é causada por mutações no gene CFTR que codifica a glicoproteína CFTR, um canal transportador de iões cloreto expresso em células epiteliais de vários órgãos. Atualmente estão identificadas cerca de 2000 mutações, sendo a mais comum a F508del - que corresponde à deleção do aminoácido fenilalanina na posição 508 e está presente em 90% dos doentes, em pelo menos um dos alelos. Esta mutação prejudica o folding e o tráfego do canal para a membrana plasmática (MP) afetando assim a função da CFTR. Ainda assim, a CFTR-F508del que consegue atingir a MP apresenta ainda defeitos no transporte de cloreto e na sua permanência e estabilidade na superfície das células. Consequentemente, a ausência funcional do canal CFTR nas células epiteliais causa deficiências em vários órgãos e sistemas, dos quais se destacam a insuficiência pancreática, a infertilidade masculina e os problemas respiratórios, de longe a manifestação com maior mortalidade, decorrente de infeções recorrentes e da inflamação crónica das vias respiratórias, que acabam por levar à falência pulmonar. Nos últimos anos têm sido feitos diversos estudos para identificar estratégias que permitam corrigir e resgatar a CFTR-F508del para a MP. A pesquisa de compostos para este efeito – denominados “corretores” – levou à descoberta de várias novas moléculas. O corretor mais promissor é o composto VX-809 que permite corrigir parcialmente o folding da CFTR-F508del e, consequentemente, promove o seu resgate para a MP. Contudo, os ensaios clínicos para este composto não mostraram melhorias significativas na maturação da CFTR-F508del em biopsias rectais, nem na função pulmonar dos doentes. Estudos posteriores demonstraram que o canal corrigido é muito instável sendo rapidamente removido da MP por endocitose. O grupo de acolhimento tem investigado este fenómeno, procurando caracterizar os mecanismos moleculares envolvidos, por forma a encontrar estratégias que permitam estabilizar a CFTR-F508del corrigida com o VX-809 na MP. Em estudos recentes do grupo mostrou-se que a ativação da proteína Ezrina e a interação do seu domínio FERM com a proteína NHERF1 estabilizam a CFTR-F508del corrigida farmacologicamente na MP através da formação do complexo macromolecular CFTR-NHERF1-Ezrina. Assim, o objetivo principal deste trabalho consistiu em identificar que subdomínios da proteína Ezrina são essenciais para esta estabilização da CFTR-F508del e utilizar esta informação para desenvolver um péptido recombinante bioativo. No desenho deste péptido de fusão foram ainda incluídos domínios de transdução proteica, de modo possibilitar a sua entrega às células alvo, e uma sequência péptido sinal eucariota, permitindo a sua síntese e secreção a partir de células de mamífero, o que possibilitou a sua produção e isolamento. Os resultados obtidos mostraram que o péptido bioativo produzido promove a estabilização na superfície celular da CFTR-F508del resgatada farmacologicamente. Foi também possível observar, através de imunofluorescência confocal, que o péptido de fusão é capaz de atravessar as membranas celulares e que possui um efeito autócrino ao ser secretado por células epiteliais brônquicas que expressam constitutivamente CFTR-F508del. Finalmente, o efeito aditivo do co-tratamento com VX-809 e a administração ectópica de péptido produzido em células HEK 293 foi demonstrado pelo aumento da atividade da CFTR-F508del em ensaios de influxo de iodeto. O segundo objetivo deste trabalho consistiu em explorar a alteração conformacional da proteína adaptadora NHERF1, que determina a estabilização da CFTR-F508del resgatada na MP, para produzir um sensor de FRET que possa vir a ser utilizado em ensaios de alto rendimento na pesquisa de alternativas químicas ou bioquímicas ao péptido bioativo produzido. Os resultados preliminares demonstraram a viabilidade do método, mas evidenciaram a necessidade de restringir a localização do sensor à MP para permitir a automação da metodologia em ensaios de alto rendimento. Por fim, analisou-se a expressão da GTPase variante RAC1b em amostras de tecido pulmonar, comparando indivíduos saudáveis com doentes de FQ (F508del+/+). A RAC1b é uma variante de splicing com propriedades antagónicas da GTPase RAC1, molécula que participa na ativação da Ezrina e é necessária à estabilização endógena da CFTR na MP. Os resultados obtidos não evidenciaram qualquer aumento de expressão desta variante em pulmões FQ F508del+/+. Não obstante, ao dosear-se a expressão de citoqueratina 8, verificou-se que a composição epitelial das amostras FQ era deficitária, pelo que a expressão de RAC1b detetada pode encontrar-se subestimada. Assim, pensa-se que os objetivos propostos para este trabalho de mestrado foram predominantemente atingidos, quer no que respeita ao desenvolvimento do péptido bioativo derivado da Ezrina, quer ao nível da construção e testes preliminares do sensor de FRET baseado na NHERF1. Assim, só não foi possível cumprir integralmente o último objetivo, pois a análise dos níveis de expressão de RAC1b em tecidos epiteliais brônquicos de doentes com FQ (F508del+/+) revelou-se inconclusiva.Cystic Fibrosis (CF) is the most common autosomal recessive genetic disease in the Caucasian population. This disease is caused by mutations in the CFTR gene which encodes the CFTR glycoprotein, a chloride channel expressed in the epithelial cells of several organs. Currently, over 2000 CF-associated mutations have been identified but the most common is F508del, which corresponds to a deletion of a phenylalanine at position 508 and is present at least in one allele in almost 90% of the patients. This mutation affects CFTR function by reducing the folding and trafficking of the channel to the plasma membrane (PM). Moreover, the little F508del-CFTR protein that reaches the PM exhibits defective chloride transport and a much reduced stability at the PM. Consequently, the absence of functional CFTR channels causes disabilities in several organs and systems, including pancreatic insufficiency, male infertility and, by far the most life threatening manifestation, respiratory problems due to chronic airway infection and inflammation that can lead to respiratory failure. Intense research in the last decades led to the identification of several compounds that can, at least, partially correct the basic defect in F508del-CFTR folding and rescue its expression to the PM. Among these compounds – termed “correctors” – the most promising so far has been VX-809, also known as lumacaftor. However, clinical trials with this drug didn’t show a statistically significant improvement in F508del-CFTR maturation on rectal biopsies or in pulmonary function. Further studies have shown that the corrected channel had fast turnover, being rapidly removed from the PM by endocytosis. The host group has investigated this effect, trying to characterize the molecular mechanisms involved, in order to find strategies to stabilize VX-809-corrected F508del-CFTR at the PM. Recent studies by the group have shown that the activation of the adaptor protein Ezrin and its interaction with the scaffold NHERF1 results in the stabilization of VX-809-corrected F508del-CFTR at the PM, through the formation of the macromolecular complex CFTR-NHERF1-Ezrin. Thus, the main goal of this work was to identify which of Ezrin’s subdomains were essential for rescued F508del-CFTR stabilization at the PM and use this results to design a novel bioactive peptide. The design of this peptide includes several molecular features that enable its synthesis and secretion from mammalian cells and its self-delivery to target cells. The results obtained showed that the produced bioactive peptide promotes the stabilization of pharmacologically rescued-F508del-CFTR at the PM. It was also possible to see, through confocal immunofluorescence, that the peptide could cross the target cell membrane and had an autocrine effect when secreted by bronchial epithelial cells that constitutively express F508del-CFTR. Finally, the additive effect of the co-treatment with VX-809 and the bioactive peptide produced in HEK 293 cells was demonstrated by the enhanced activity of F508del-CFTR in iodide influx assays. The second goal of this work was to study the conformational changes of NHERF1 adaptor protein that determines the rescued-F508del-CFTR stabilization at the PM, to produce a FRET sensor which may be used in high-throughput screening in the search for chemical or biochemical alternatives to the bioactive peptide produced. Preliminary designs of the sensor demonstrated sensitivity to Ezrin activation, but evidenced the need to restrict the localization of the sensor to the PM to allow the automation of the methodology in high-throughput screening. Finally, we analysed the expression of the RAC1 GTPase splice variant, RAC1b, on pulmonary tissues samples, comparing healthy individuals with CF patients (F508del+/+). The RAC1b has properties that antagonise RAC1 signalling, and could thus hinder endogenous Ezrin activation destabilizing the CFTR channels at the PM. However, the obtained data didn’t show any increase of the expression of this variant in F508del+/+ lungs. Thus, the proposed goals of this master’s thesis work were predominantly achieved, regarding the development of the Ezrin-derived bioactive peptide and the preliminary designs of the NHERF1-based FRET sensor. However, the analysis of RAC1b expression levels on bronchial tissues of F508del+/+ CF patients revealed no significant differences when compared to healthy controls.Matos, Paulo Henrique Carrasquinho de,1973-Repositório da Universidade de LisboaNeno, Vanessa Isabel Rodrigues2020-10-28T01:30:14Z201720172017-01-01T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/31986TID:201856662porinfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2023-11-08T16:25:54Zoai:repositorio.ul.pt:10451/31986Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T21:47:19.702047Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse |
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