Development of cellular models for NIS functional expression
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| Data de Publicação: | 2021 |
| Tipo de documento: | Dissertação |
| Idioma: | eng |
| Título da fonte: | Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) |
| Texto Completo: | http://hdl.handle.net/10451/48250 |
Resumo: | Tese de mestrado em Bioquímica (Bioquímica Médica),Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2021 |
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Development of cellular models for NIS functional expressionSimportador de sódio/iodo (NIS)IodoTratamento com iodo radioativo (RAI)ClonagemImunofluorescênciaTeses de mestrado - 2021Domínio/Área Científica::Ciências Naturais::Ciências QuímicasTese de mestrado em Bioquímica (Bioquímica Médica),Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2021O simportador de sódio/iodo (NIS ou SLC5A5) é uma glicoproteína membranar que medeia o transporte ativo de iodo da corrente sanguínea para as células foliculares da tiroide. Este transporte é essencial na biossíntese das hormonas da tiroide, tri-iodotironina (T3) e tiroxina (T4), hormonas que controlam o metabolismo e têm um papel muito importante no desenvolvimento neurológico fetal e das quais o iodo é um constituinte fundamental. O iodo em circulação no sangue entra nas células foliculares da tiroide, passando depois para o lúmen folicular, onde é oxidado e incorporado na tiroglobulina (Tg) por ação da tiroide peroxidase (TPO) em conjunto com o peróxido de hidrogénio (H2O2) que é produzido através da ação da dual oxidase 2 (DUOX2). Este processo de incorporação do iodo é chamado de “organificação”, que resulta na formação de mono- e diiodotirosina (MIT e DIT). Assim o iodeto está covalentemente ligado nas posições 3 e 4 dos resíduos de tirosil da Tg e estes resíduos iodinizados são usados para a síntese das hormonas da tiroide. A Tg iodinizada é depois armazenada no lúmen folicular, sendo internalizada e clivada proteoliticamente nos lisossomas, sendo assim libertadas as hormonas T3 e T4 na corrente sanguínea. A hormona estimuladora da tiroide (TSH) regula o transporte de iodo para a tiroide. Esta hormona é produzida na adeno-hipófise e é regulada pela hormona libertadora de tireotrofina (TRH) e pelo nível circulante das hormonas da tiroide, havendo um feedback negativo, já que as hormonas da tiroide inibem a produção de TRH. Por outro lado, uma quantidade excessiva de iodeto nas células foliculares pode inibir o transporte de iodo e de “organificação”, inibindo o NIS e a TPO. A diminuição das concentrações de iodo pode levar ao aparecimento de desordens de deficiência de iodo (IDD´s), que constituem um sério risco de saúde mundial. O NIS é uma proteína que é bastante regulada ao nível da transcrição, quer ao nível epigenético, quer ao nível pós-transcripcional, especialmente em relação à sua localização celular. A sua expressão e localização é controlada pela TSH e pelo iodo, sendo promovida pela TSH e inibida pelo excesso de iodo. Esta proteína também está sujeita a bastantes modificações pós-transcripcionais, como fosforilações e sumoilações, e apresenta vários motivos ligados à interação entre proteínas, nomeadamente na sua porção C-terminal. Estes motivos são muito importantes na localização do NIS na membrana celular das células foliculares da tiroide. As citoquinas também mostram ter um papel fundamental na modulação da função do NIS nas células da tiroide, podendo afetar a função da glândula e o seu crescimento, bem como o estradiol, que mostrou ter um papel crucial na modulação do NIS. Este é responsável pelo aumento da glândula da tiroide e pela reduzida expressão do gene do NIS. Hormonas e fatores de crescimento também afetam a expressão de NIS nas células da tiroide. O NIS também é expresso em células cancerígenas da tiroide, sendo esta a neoplasia endócrina mais frequente. No entanto, neste tipo de neoplasia a expressão de NIS funcional encontra-se diminuída, uma vez que a regulação transcripcional e pós-transcripcional do NIS envolve vias de sinalização que também estão implicadas na progressão e agressividade tumoral e que se encontram ativadas neste tipo de malignidades. Entre estas vias de sinalização destacam-se a MAPK/ERK e a PI3K/AKT/mTOR. O cancro da tiroide pode derivar dos componentes foliculares e parafoliculares da glândula da tiroide, sendo a cirurgia o principal tratamento, independentemente do subtipo histológico. Dentro do subtipo folicular de carcinomas da tiroide, existem 3 categorias no que diz respeito ao seu nível de diferenciação: bem diferenciados (well differentiated thyroid carcinoma - WDTC), pouco diferenciados (poorly differentiated thyroid carcinoma - PDTC) e anaplásicos (anaplastic thyroid carcinoma - ATC). Os WDTC podem ser do subtipo papilar (papillary thyroid carcinoma - PTC) ou folicular (folicular thyroid carcinoma – FTC). Os WDTC são caracterizados por ter um prognóstico favorável devido à eficácia combinada da cirurgia e do uso de iodo radioativo (RAI). O RAI, é uma importante ferramenta de diagnóstico e terapêutica para doenças malignas e benignas, para monitorizar e eliminar células cancerígenas remanescentes, bem como metástases após tiroidectomia total. A falta de resposta ao tratamento por RAI deve-se a defeitos na maturação, transporte para a membrana e expressão do NIS em células cancerígenas da tiroide, o que leva a uma diminuição no transporte de iodo nestas células. Várias tentativas têm sido feitas com vista a aumentar a expressão de NIS através da manipulação das vias de sinalização do MAPK/ERK e PI3K/AKT. Por exemplo, o uso de inibidores, como o Selumetinib levou a um aumento da captação de RAI em lesões refratárias ao iodo de doentes com cancro da tiroide. Outros inibidores também têm sido usados, como inibidores de cinases e agentes desmetilantes, no entanto com pouco sucesso, uma vez que estas tentativas se focam essencialmente no aumento da expressão do NIS. No entanto, o transporte do NIS para a membrana está diminuído em vários modelos de cancro da tiroide, até em casos em que os níveis de mRNA estão normais ou mesmo aumentados. Isto significa que o processamento pós-transcripcional do NIS, bem como o seu transporte e retenção na membrana é muito importante na eficiência da terapia com RAI. O NIS também é expresso noutros tecidos, incluindo células salivares, nos enterócitos intestinais, na placenta e no tecido mamária durante a lactação, bem como em células de cancro da mama. De facto, cerca de 80% dos carcinomas da mama também expressam NIS, mas a níveis muito baixos para justificar o tratamento com RAI. No entanto, tem sido proposto que caso fosse possível aumentar a expressão funcional de NIS nestes tumores, o uso de RAI como uma terapia coadjuvante seria provavelmente benéfico para muitos pacientes. Por isso, é importante o aumento da abundância e estabilidade do NIS na membrana, em vista a melhorar a captação de RAI. O objetivo deste projeto é o desenvolvimento e avaliação da integridade funcional de uma proteína NIS marcada com duas marcas peptídicas: uma localizada num domínio extracelular (a marca HA tripla) que permita a deteção específica do NIS na superfície celular, bem como uma marca fluorescente (marca CFP) na sua porção C-terminal citoplasmática, que permita a monitoração da sua localização subcelular durante o seu trafego membranar. A construção destas proteínas NIS marcadas visa o posterior desenvolvimento de sistemas celulares experimentais representativos de tecidos neoplásicos e não neoplásicos da tiroide. Através desta estratégia vários sistemas celulares podem ser comparados. Isto permitirá o estudo do impacto de várias vias de sinalização representativas da progressão e agressividade tumoral no transporte e retenção do NIS na membrana plasmática, bem como a validação de alvos moleculares para o aumento da expressão de NIS funcional e o aumento da captação de iodo. Neste trabalho, foram desenvolvidas três construções da proteína NIS contendo a marca peptídica HA extracelular (NIS-HA) e a marca peptídica CFP em diferentes localizações do domínio citoplasmático, na tentativa de preservar os elementos regulatórias da porção C-terminal do NIS: NIS HA-CFP, NIS-HA-CFP-Cter, NIS-HA-CFP-pre-Cter. Estas construções proteicas permitiram a deteção específica do NIS na superfície celular de células intactas e a deteção específica do mesmo, desde a sua biossíntese até ao seu transporte e retenção na membrana plasmática, através de ensaios de biotinilação de proteínas de superfície e microscopia de fluorescência. O NIS-HA-CFP parece ser, entre as construções sintetizadas, o que apresenta uma maior expressão. Também é importante referir que o NIS HA-CFP apresenta uma distribuição celular distinta, quando comparada com as outras construções, estando mais acumulado na região perinuclear, enquanto o NIS-HA-CFP-Cter se encontra em regiões definidas na periferia celular. Também observámos que a marcação na superfície celular das construções CFP-tagged era menor do que no NIS-HA (sem marca CFP). No que respeita a marcação na superfície celular, as construções NIS-HA-CFP e o NIS-HA-CFP-Cter apresentaram uma forte marcação, enquanto que a da construção NIS-HA-CFP-pre-Cter, revelou-se fraca. Serão necessários estudos subsequentes para avaliar a capacidade funcional de cada uma destas construções, nomeadamente, a sua capacidade de importe de iodo através de ensaios de influxo de iodo. Este trabalho poderá contribuir para uma melhor compreensão dos mecanismos subjacentes à expressão do NIS, ao serem usados como repórteres do NIS endógeno tanto em células normais como em células cancerígenas. Serão assim usados no estabelecimento de linhas celulares e para o teste de alvos moleculares que possam levar ao aumento da expressão membranar de NIS e o consequente aumento da captação de RAI. Isto poderá contribuir para o desenvolvimento de estratégias que visem a melhoria da eficiência da terapêutica com RAI, que poderão se aplicadas ao carcinoma da tiroide refratário ao iodo ou mesmo a outras condições malignas, não-tiroideias, como é o caso do carcinoma da mama.The sodium/iodide symporter (NIS or SLC5A5) is an intrinsic plasma membrane glycoprotein that mediates active transport of iodide into the thyroid follicular cells. NIS mediated iodide uptake plays a key role in the biosynthesis of the thyroid hormones. NIS is also expressed in thyroid cancer (TC) cells. This expression allows the use of radioactive iodide (RAI), which is an important diagnostic and therapeutic tool for malignant and benign diseases, to monitor and eliminate remaining tumor cells and metastases after total thyroidectomy. The lack of response to RAI treatment is due to reduced expression of NIS in TC cells but also to defects in its maturation and targeting to the membrane. The aim of this project is the construction of a double tagged NIS protein and the assessment of its functional integrity, intended for development of experimental cells systemsrepresentative of thyroid non-neoplastic and cancer tissues. These will be engineered to express a fully functional NIS protein containing the triple-HA tag and a fluorescent CFP-tag, while preserving the integrity of the C-terminal regulatory elements. Through this strategy diverse cellular systems can be compared despite having distinct levels of endogenous NIS expression, and potential interferences resulting from NIS transcriptional regulation are avoided. In this project, three CFP-tagged NIS-HA constructs were generated and compared with respect to their functionality. The presence of the CFP tag allowed the detection of NIS subcellular localization by fluorescence microscopy. These newly synthetized constructs were further specifically detected at the cell surface of intact cells. The results of this work provided a useful tool to investigate how NIS is regulated and retained at the cell surface. Understanding these mechanisms will ultimately allow the development of novel therapeutic approaches to enhance the iodide uptake and RAI efficacy.Silva, Ana LuísaHerrera, FedericoRepositório da Universidade de LisboaMartins, Bruno Alexandre Dias2024-02-18T01:30:48Z202120212021-01-01T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/48250TID:202934578enginfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2024-02-19T01:18:02Zoai:repositorio.ul.pt:10451/48250Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T22:00:09.668199Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse |
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