Genotipagem do Human Leucocyte Antigen (HLA): Técnicas atuais e aplicabilidade da abordagem de Next Generation Sequencing

• Autor(a) principal: Barbosa, Ana Clara Nunes
• Data de Publicação: 2019
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: eng
• Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
• Texto Completo: http://hdl.handle.net/10348/9554
• topic: HLA; genotipagem

O complexo MHC (Major Histocompatibility Complex) está presente em todos os mamíferos e, no homem é designado HLA (Human Leucocyte Antigen). Este cluster de genes está localizado no braço curto do cromossoma 6 (6p21) e possui mais de 220 genes, sendo uma das regiões mais intensivamente estudadas no genoma humano há mais de 20 anos, sendo que ainda nos dias de hoje é alvo de vários estudos. O complexo génico HLA é um dos mais polimórficos do genoma humano e divide-se em três regiões: HLA classe I, II e III. A principal função das moléculas de MHC é a apresentação de fragmentos peptídicos provenientes de agentes patogénicos e exibi-los à superfície das células de forma a serem reconhecidos e eliminados adequadamente pelos linfócitos T. Desde a descoberta do HLA, vários estudos contribuíram para a melhor compreensão da resposta imunitária. As primeiras associações entre a região HLA e determinadas doenças reforçaram a ideia já existente, da complexidade deste cluster de genes e o seu extenso polimorfismo. Com o passar do tempo, foi possível verificar que determinados genótipos HLA estão associados com um grande número de doenças, bem como a reações adversas a certos fármacos e com a compatibilidade HLA na transplantação. O estudo desta região permitiu perceber muitas das suas características únicas, despertando um grande interesse tanto a nível clínico como científico, de tal forma que várias técnicas de genotipagem HLA foram desenvolvidas. Inicialmente a genotipagem era feita através de métodos serológicos, no entanto não eram completamente satisfatórios. Foi necessário desenvolver métodos de tipagem mais robustos e específicos: PCR-SSP (Sequence Specific Primer), PCR-SSO (Sequence Specific Oligonucleotide) e PCR-SBT (Sequencing based typing). No entanto, estes também apresentam resultados com ambiguidades, dependendo do tipo de metodologia e kit usado. Mais recentemente o desenvolvimento da tecnologia NGS (Next Generation Sequencing) permitiu um maior nível de resolução entre outras vantagens discutidas ao longo deste trabalho. O presente trabalho teve como objetivos a aplicação das técnicas clássicas de genotipagem de HLA e a revisão sobre a aplicabilidade de NGS nesta área. Neste estudo, após utilização das técnicas, foram calculadas as frequências alélicas para as amostras de dadores de medula e de sangue do cordão umbilical. Para os genes HLAA, -B, -C e –DRB1, os alelos mais frequentes foram os mesmos em ambos os tipos de amostras, tendo sido o HLA-A*02 com frequências alélicas de 26,83% e 27,55%; HLA-B*44 com 14,34% e 13,96%; HLA-C*07 com 24,66% e 25,66%; e o gene HLA-DRB1*07 com 18,09% e 16,60%, para as amostras de dadores de medula e sangue do cordão, respetivamente. Estas frequências alélicas descritas relativamente às amostras de dadores de medula óssea voluntários e amostras de cordão a nível do Norte de Portugal mostram uma semelhança com as frequências alélicas obtidos por outros autores relativamente à população Portuguesa. Com base na literatura, a introdução da tecnologia NGS nos laboratórios clínicos trará inúmeros benefícios, principalmente ao nível da compatibilidade dador-recetor. Esta tecnologia acarreta menos ambiguidades, menos custos associados à medida que a tecnologia evolui e para além disso, permitirá aumentar o nosso conhecimento relativamente à relevância biológica não só das regiões codificantes, mas principalmente das regiões não codificantes, já que permite a sequenciação mais alargada dos genes. Os estudos apresentados revelam dados bastantes satisfatórios quanto à aplicabilidade a nível laboratorial do NGS, com taxas de precisão acima dos 97% na genotipagem HLA.