Antimicrobial resistance at the livestock-wildlife-human interface using wild boar, fallow deer and red deer as models
| Autor(a) principal: | |
|---|---|
| Data de Publicação: | 2019 |
| Tipo de documento: | Dissertação |
| Idioma: | eng |
| Título da fonte: | Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) |
| Texto Completo: | http://hdl.handle.net/10451/39034 |
Resumo: | Tese de mestrado em Microbiologia Aplicada, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2019 |
| id |
RCAP_3f22fdc489e35641421c28ab83b4f62b |
|---|---|
| oai_identifier_str |
oai:repositorio.ul.pt:10451/39034 |
| network_acronym_str |
RCAP |
| network_name_str |
Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) |
| repository_id_str |
7160 |
| spelling |
Antimicrobial resistance at the livestock-wildlife-human interface using wild boar, fallow deer and red deer as modelsResistência antimicrobianaFauna silvestreEscherichia coliEnterococcus spp.Staphylococcus spp.Teses de mestrado - 2019Domínio/Área Científica::Ciências Naturais::Ciências BiológicasTese de mestrado em Microbiologia Aplicada, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2019A resistência antimicrobiana (AMR) é um processo comum na Natureza que, devido à normal variação e evolução genética das populações microbianas e à pressão exercida por agentes antimicrobianos, conduz à fixação na população de genes/genótipos que promovem a resistência, bem como à sua transmissão às gerações seguintes. No entanto, a resistência antimicrobiana de microrganismos comensais, particularmente bactérias, tem aumentado acentuadamente, tornando-se num grande problema de saúde publica do século XXI, com consequências clínicas e económicas muito preocupantes. Alguns dos fatores que aceleram este processo natural de evolução genética são, nomeadamente, o uso inadequado e abusivo de antibióticos, a existência de habitats cada vez mais humanizados, a descarga de antibióticos no meio ambiente, entre muitos outros fatores, sendo cada vez mais difícil combater infeções de bactérias (multi)resistentes. Estas condições promovem a circulação e disseminação de bactérias resistentes, bem como dos seus elementos genéticos móveis, entre humanos, animais e o ambiente. Para enfrentar a ameaça global da resistência antimicrobiana, são necessários estudos mais detalhados sobre a complexa ecologia na interface homem-pecuária-vida selvagem, sendo que as fontes e vias de transmissão da AMR no compartimento da vida selvagem não são ainda claras. Assim, neste trabalho, pretendeu-se avaliar a resistência antimicrobiana no compartimento selvagem, utilizando como modelo populações selvagens ou de vida livre de ungulados silvestres, nomeadamente javali (Sus scrofa), veado-vermelho (Cervus elaphus) e gamo (Dama dama). Para além da facilidade de amostragem, a escolha destes ungulados como modelo teve por base a complexa teia de interações que estas espécies estabelecem, permitindo estudar a dinâmica da transmissão de genes de AMR de diferentes fontes e entender os fatores subjacentes a essa dinâmica. Para além disso, são mamíferos de grande porte que têm uma distribuição mundial e muito abundantes na Europa, cujas populações estão em expansão, nomeadamente em Portugal, ocupando uma grande variedade de ambientes. Sendo assim, a escolha destes ungulados recaiu no facto de terem uma larga distribuição geográfica, particularmente o javali, uma área vital alargada, baixa probabilidade de lhe terem sido administrados antibióticos e a sobreposição do seu habitat com vários outros, servindo de ligação entre ambientes influenciados pelo Homem (ambientes humanizados) e áreas naturais. Para avaliar a dinâmica de transmissão de genes de resistência, os modelos bacterianos focados neste estudo foram: Escherichia coli, Salmonella spp., Enterococcus faecium, Enterococcus faecalis, Staphylococcus epidermidis e Staphylococcus aureus. Esta escolha assentou na sua relevância como microrganismos comensais e/ou agentes patogénicos humanos de origem alimentar, bem como no seu potencial como reservatórios de genes de resistência. Acresce que estas espécies bacterianas são frequentemente utilizadas como modelo em estudos de resistência a antibióticos, nomeadamente nos compartimentos humano e pecuário, e para as quais existem dados de suscetibilidade disponíveis, passíveis de comparação com dados obtidos no compartimento selvagem. Os objetivos deste trabalho foram assim, especificamente, a avaliação: [1] da presença de bactérias (multi)resistentes na microflora comensal de animais selvagens, nomeadamente Enterococcus spp., Staphylococcus spp. e Escherichia coli, designadamente os serotipos produtores de toxina Shiga (STEC); [2] da influência exercida por fatores ambientais, ecológicos e de perturbação na dinâmica da transmissão da resistência antimicrobiana. Para o efeito, foram recolhidas 56 amostras fecais, das quais 12 provenientes de javali, sete de gamo e 37 de veado, de todo o território nacional continental. As amostras foram recolhidas de forma oportunística em montarias (veado e javali) ou ações de captura de animais em vida, com recurso a sedação, para avaliação do seu estado de saúde (gamo), não se tendo em conta a idade, género e habitat dos espécimes. Para isolamento de E. coli e de Salmonella spp., as amostras foram enriquecidas em água peptonada e, posteriormente, plaqueadas em agar MacConkey, meio seletivo para o isolamento de E. coli, e em meio Rappaport-Vassiliadis (MRSV) modificado, meio seletivo para o isolamento de Salmonella spp.. No caso de se observar crescimento bacteriano com a produção de halos brancos em meio MRSV, sugestivo da presença de Salmonella spp., as bactérias correspondentes seriam repicadas para os meios XLD e Harlequin Salmonella ABC. Para o isolamento de E. faecalis e E. faecium, as amostras foram enriquecidas em Azide Dextrose Broth e posteriormente plaqueadas em Membrane-filter Enterococcus Selective agar. Por fim, para o isolamento de S. aureus e S. epidermidis, as amostras foram enriquecidas em caldo Brain Heart Infusion (BHI) suplementado com 6,5% de NaCl e posteriormente plaqueadas em Mannitol Salt Agar (MAS). De todos estes meios de cultura, quatro colónias bacterianas, com as características morfológicas e coloração típica das espécies bacterianas de interesse, foram purificadas em Luria Agar (LA) e, seguidamente, sujeitas a testes fenotípicos, nomeadamente coloração de Gram, coloração de endósporos, e testes para detetar a presença das enzimas catalase e citocromo c oxidase. Os isolados bacterianos foram congelados e, os que apresentavam as características presuntivas das espécies de interesse, foram submetidas a genotipagem por recurso à técnica de amplificação aleatória de DNA polimórfico (RAPD), utilizando o primer PH, o qual é um primer universal que amplifica uma parte do gene rRNA 16S. A relação entre os diferentes isolados foi analisada utilizando métodos hierárquicos numéricos com o coeficiente de correlação de Pearson e o método de aglomeração Unweighted Pair Group Method with Arithmetic mean (UPGMA). Dentro de cada grupo estabelecido, selecionou-se um isolado de cada hospedeiro para identificação molecular, usando a técnica de amplificação em cadeia da polimerase (PCR) e primers direcionados à amplificação de alvos específicos de cada espécie bacteriana em estudo. Os isolados identificados como E. coli (n = 98) foram posteriormente submetidos a um PCR multiplex com o objetivo de aferir a presença dos genes de virulência eae, stx1 e stx2 e a presença de genes associados ao serovares O26, O103, O104, O111, O145 e O157 de E. coli. Dos 98 isolados de E. coli testados, apenas três pertencem aos serovares pesquisados [O104 (n = 1); O103 (n = 2)] e dois isolados (diferentes dos anteriores) possuem, pelo menos, um dos genes de virulência analisados (num isolado amplificou-se o gene stx1, enquanto noutro isolado os genes stx1/stx2). Os isolados confirmados molecularmente como pertencentes às espécies bacterianas em estudo, E. coli (n = 98), E. faecium (n = 11), E. faecalis (n = 4) e S. epidermidis (n = 5), foram sujeitos a testes de suscetibilidade a antibióticos. Os antibióticos testados em E. coli, pertencentes a quatro classes, foram (μg/disco): ampicilina [AMP] (10), cefoxitina [FOX] (30), cefotaxima [CTX] (5), ceftazidima [CAZ] (10), meropenem [MEM] (10), gentamicina [GEN] (10), trimetoprim [TMP] (5) e cloranfenicol [CHL] (30). Os isolados de S. epidermidis, foram testados com os seguintes antibióticos, pertencentes a duas classes (μg/disco): minociclina [MIN] (30) e tobramicina [TOB]. Por último, os antibióticos testados para os isolados pertencentes às espécies E. faecium e E. faecalis, foram (μg/disco): ampicilina [AMP] (2), gentamicina [GEN] (30), vancomicina [VAN] (5), teicoplanina [TEC] (30) e linezolide [LZD] (10), os quais pertencem a quatro classes de antibióticos. Para os testes de suscetibilidade aos antimicrobianos, procedeu-se metodologicamente de acordo com as diretrizes do Comité Europeu de Testes de Suscetibilidade Antimicrobiana (EUCAST) e a interpretação dos diâmetros dos halos de inibição foi realizada de acordo com os limites (cut-offs) epidemiológicos (ECOFF). Os ECOFF permitem a distinção de bactérias com fenótipo selvagem [wild-type (WT)], as quais são caracterizadas pela resistência natural e ausência de mecanismos de resistência adquiridos, das bactérias com fenótipo non-wild-type (NWT), ou seja, por oposição, aquelas que adquiriram mecanismos de resistência face ao seu perfil natural de resistência. Assim, 10,20% da população de E. coli apresentou um fenótipo NWT para, pelo menos, um antibiótico, tendo-se obtido os seguintes resultados discriminados por antibiótico: trimetoprim (6,12%), gentamicina (4,08%) e ampicilina (5,10%). Relativamente aos testes de suscetibilidade a antibióticos realizados em E. faecium, 18,18% da população testada apresentou um fenótipo non-wild-type para, pelo menos, um antibiótico, obtendo-se as seguintes percentagens: vancomicina (9,09%), teicoplanina (18,18%) e linezolide (9,09%). Os isolados de E. faecalis também foram testados para este conjunto de antibióticos, tendo todos sido considerados wild type. Por fim, 60% da população de isolados de S. epidermidis apresentou fenótipo non-wild-type contra a tobramicina. No entanto, estes últimos resultados não podem ser extrapolados para a população, uma vez que apenas foram testados os cinco isolados de S. epidermidis obtidos, o que limita as conclusões. Após os resultados dos testes de suscetibilidade antimicrobiana, foi testada a hipótese de o fenótipo de resistência depender da espécie, idade, género ou localização/área geográfica do hospedeiro. Após análise, verificou-se uma associação estatisticamente significativa do fenótipo non-wild-type com a espécie de hospedeiro, e de fatores associados à sua história de vida, nomeadamente idade, género e área geográfica da captura. Estes resultados sugerem que a resistência a antibióticos não depende apenas de um único fator, mas sim de uma complexa interação entre fatores bióticos e abióticos, sendo necessários estudos multidisciplinares para a análise da interação dos vários componentes. Este estudo sugere ainda que os animais silvestres pesquisados poderão constituir uma fonte de E. coli potencialmente patogénica, ainda que a prevalência registada seja muito baixa.Antimicrobial resistance (AMR) occurs naturally over time and space due to normal genetic variation and evolution in bacterial populations. However, it became a huge concern in the 21st century because many factors, like overuse and misuse of antibiotics in human and animal populations, the overlap of animal and human habitats and the widespread discharge of antimicrobials, are accelerating genetic evolution processes underlying antimicrobial resistance, being increasingly more difficult to combat infections caused by (multi)resistant bacteria. These factors promote links between human, animal and the environment that enable the circulation and dissemination of resistant bacteria, as well as their mobile genetic elements. To face the global threat of AMR, more detailed studies on its complex ecology at the human-livestock-wildlife interface are crucial. The sources and transmission routes of AMR in the wildlife compartment are still unclear, so in this work the main focus was to evaluate antimicrobial resistance in the wild, using as models free-ranging wild ungulates populations, namely wild boar (Sus scrofa), red deer (Cervus elaphus) and fallow deer (Dama dama), since they may establish the link between the transmission routes of antibiotic resistance encoding genes from different sources, through a complex web of interactions, large home range, unlikeliness of being treated with antibiotics, and/or habitat overlap with livestock and humans. The aim of this work was thus the appraisal of: [1] the extent to which wild animals harbour and act as reservoirs of (multi)resistant bacteria, namely Enterococcus spp., Staphylococcus spp. and Escherichia coli, such as Shiga-toxin producing E. coli (STEC), and [2] the influence exerted by environmental, ecological and disturbance factors on antimicrobial resistance dynamics. To address these objectives, freshly collected faecal samples from 12 wild boar, 7 fallow deer and 37 red deer, sampled in mainland Portugal, were divided into portions of 1 g, enriched and then cultured in selective media for detection and isolation of Escherichia coli, Salmonella spp., Enterococcus faecium, Enterococcus faecalis, Staphylococcus epidermidis and Staphylococcus aureus. These bacterial species were selected for this study because of their relevance as human commensals, food-borne pathogens or their potential as reservoirs of antibiotic resistance genes. To isolate Escherichia coli and Salmonella spp., the samples were enriched in Buffered Peptone Water and then cultured, respectively, onto MacConkey agar and Rappaport-Vassiliadis (MRSV) medium semisolid modified. Any potential Salmonella growth would be confirmed in Xylose Lysine Deoxycholate (XLD) and Harlequin Salmonella ABC. In this screening, no Salmonella spp. was detected. For the isolation of Enterococcus faecium and Enterococcus faecalis, the samples were enriched in Azide Dextrose Broth and, posteriorly, cultured onto Membrane-filter Enterococcus agar. Lastly, to isolate Staphylococcus epidermidis and Staphylococcus aureus, the samples were enriched in Brain Heart Infusion (BHI) broth supplemented with 6.5% of NaCl and then cultured onto Mannitol Salt agar (MSA). The isolates were subjected to phenotypic characterization and the ones with the presumptive characteristics of the bacterial species pretended (n = 426) were stored and subjected to a random amplification of polymorphic DNA (RAPD) fingerprinting with PH primer. Strain relationships were analysed by hierarchical numerical methods with Pearson correlation coefficient and Unweighted Pair Group Method with Arithmetic mean (UPGMA) clustering. This technique allowed to group the isolates and select one from each host within each cluster for molecular identification using PCR and primers targeted at each bacterial species under focus. Based on this approach, no isolates could be identified as S. aureus. The isolates confirmed as E. coli (n = 98) were posteriorly subjected to a multiplex PCR with the purpose of targeting the virulence genes eae, stx1 and stx2 and the presence of E. coli O26, O103, O104, O111, O145 and O157 serogroup-associated genes. All the isolates identified as E. coli, E. faecium (n = 11), E. faecalis (n = 4) and S. epidermidis (n = 5), were subjected to antibiotic susceptibility tests according to EUCAST guidelines. For E. coli, antibiotics tested were (μg/disc): ampicillin [AMP] (10), cefoxitin [FOX] (30), cefotaxime [CTX] (5), ceftazidime [CAZ] (10), meropenem [MEM] (10), gentamicin [GEN] (10), trimethoprim [TMP] (5) and chloramphenicol [CHL] (30), belonging to four different classes of antibiotics. For S. epidermidis, antibiotics tested were (μg/disc): minocycline [MIN] (30) and tobramycin [TOB], belonging to two antibiotic classes. For E. faecium and E. faecalis, antibiotics tested were (μg/disc): ampicillin [AMP] (2), gentamicin [GEN] (30), vancomycin [VAN] (5), teicoplanin [TEC] (30) and linezolid [LZD] (10), which belong to four different antibiotic classes. The interpretation of inhibition zone diameters was performed according to epidemiological cut-offs (ECOFFs). Accordingly, 10.20% of the E. coli population showed a non-wild-type (non-WT) phenotype against at least one antibiotic, including trimethoprim (6.12%), gentamicin (4.08%) and ampicillin (5.10%). Similarly, 18.18% of the E. faecium population tested showed a non-wild-type phenotype against at least one antibiotic, including vancomycin (9.09%), teicoplanin (18.18%) and linezolid (9.09%). E. faecalis isolates were also tested for this set of antibiotics and it was observed that all the isolates were considered WT. Lastly, 60% of the S. epidermidis population showed non-WT phenotype against tobramycin. However, interpretation of these results is limited, since only five isolates of S. epidermidis were obtained. The hypothesis of the non-wild type phenotype being dependent on the host’s species, age, sex and location were tested and, by statistical analysis, it was determined a statistically significant association between the non-wild-type phenotype and those factors.Cunha, Mónica VieiraRepositório da Universidade de LisboaFerreira, Ana Filipa Meneses2022-03-30T00:30:52Z201920192019-01-01T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/39034TID:202260127enginfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2023-11-08T16:37:14Zoai:repositorio.ul.pt:10451/39034Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T21:52:48.664434Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse |
| dc.title.none.fl_str_mv |
Antimicrobial resistance at the livestock-wildlife-human interface using wild boar, fallow deer and red deer as models |
| title |
Antimicrobial resistance at the livestock-wildlife-human interface using wild boar, fallow deer and red deer as models |
| spellingShingle |
Antimicrobial resistance at the livestock-wildlife-human interface using wild boar, fallow deer and red deer as models Ferreira, Ana Filipa Meneses Resistência antimicrobiana Fauna silvestre Escherichia coli Enterococcus spp. Staphylococcus spp. Teses de mestrado - 2019 Domínio/Área Científica::Ciências Naturais::Ciências Biológicas |
| title_short |
Antimicrobial resistance at the livestock-wildlife-human interface using wild boar, fallow deer and red deer as models |
| title_full |
Antimicrobial resistance at the livestock-wildlife-human interface using wild boar, fallow deer and red deer as models |
| title_fullStr |
Antimicrobial resistance at the livestock-wildlife-human interface using wild boar, fallow deer and red deer as models |
| title_full_unstemmed |
Antimicrobial resistance at the livestock-wildlife-human interface using wild boar, fallow deer and red deer as models |
| title_sort |
Antimicrobial resistance at the livestock-wildlife-human interface using wild boar, fallow deer and red deer as models |
| author |
Ferreira, Ana Filipa Meneses |
| author_facet |
Ferreira, Ana Filipa Meneses |
| author_role |
author |
| dc.contributor.none.fl_str_mv |
Cunha, Mónica Vieira Repositório da Universidade de Lisboa |
| dc.contributor.author.fl_str_mv |
Ferreira, Ana Filipa Meneses |
| dc.subject.por.fl_str_mv |
Resistência antimicrobiana Fauna silvestre Escherichia coli Enterococcus spp. Staphylococcus spp. Teses de mestrado - 2019 Domínio/Área Científica::Ciências Naturais::Ciências Biológicas |
| topic |
Resistência antimicrobiana Fauna silvestre Escherichia coli Enterococcus spp. Staphylococcus spp. Teses de mestrado - 2019 Domínio/Área Científica::Ciências Naturais::Ciências Biológicas |
| description |
Tese de mestrado em Microbiologia Aplicada, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2019 |
| publishDate |
2019 |
| dc.date.none.fl_str_mv |
2019 2019 2019-01-01T00:00:00Z 2022-03-30T00:30:52Z |
| dc.type.status.fl_str_mv |
info:eu-repo/semantics/publishedVersion |
| dc.type.driver.fl_str_mv |
info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| format |
masterThesis |
| status_str |
publishedVersion |
| dc.identifier.uri.fl_str_mv |
http://hdl.handle.net/10451/39034 TID:202260127 |
| url |
http://hdl.handle.net/10451/39034 |
| identifier_str_mv |
TID:202260127 |
| dc.language.iso.fl_str_mv |
eng |
| language |
eng |
| dc.rights.driver.fl_str_mv |
info:eu-repo/semantics/openAccess |
| eu_rights_str_mv |
openAccess |
| dc.format.none.fl_str_mv |
application/pdf |
| dc.source.none.fl_str_mv |
reponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informação instacron:RCAAP |
| instname_str |
Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informação |
| instacron_str |
RCAAP |
| institution |
RCAAP |
| reponame_str |
Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) |
| collection |
Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) |
| repository.name.fl_str_mv |
Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informação |
| repository.mail.fl_str_mv |
|
| _version_ |
1799134465464729600 |