Molecular mechanisms of immunomodulatory drugs resistance in Multiple Myeloma
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| Data de Publicação: | 2023 |
| Tipo de documento: | Dissertação |
| Idioma: | eng |
| Título da fonte: | Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) |
| Texto Completo: | http://hdl.handle.net/10316/105978 |
Resumo: | Dissertação de Mestrado em Bioquímica apresentada à Faculdade de Ciências e Tecnologia |
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Molecular mechanisms of immunomodulatory drugs resistance in Multiple MyelomaMecanismos moleculares de resistência a imunomoduladores no Mieloma MúltiploProteasome InhibitorsDrug-resistanceABC transportersMieloma MúltiploImunomoduladoresInibidores do ProteasomaResistência a fármacosTransportadores ABCMultiple MyelomaImmunomodulatorsDissertação de Mestrado em Bioquímica apresentada à Faculdade de Ciências e TecnologiaO Mieloma Múltiplo (MM) é uma neoplasia hematológica caracterizada pela presença de plasmócitos malignos monoclonais na medula óssea e pela presença dos denominados eventos definidores de mieloma. A introdução de novas classes de fármacos, nomeadamente inibidores do proteasoma (PI), imunomoduladores (IMiDs) e anticorpos monoclonais (AcMo), no tratamento do MM tem-se acompanhado de um aumento da sobrevivência dos doentes. Associados em esquemas terapêuticos com os PI e AcMo, atualmente são utilizados diferentes imunomoduladores no tratamento do MM, como a Lenalidomida (LEN) e a Pomalidomida (POM), sendo que esta classe de fármacos tem como alvo principal a proteína ligase E3 cereblon (CRBN). No entanto, esta patologia continua incurável sendo um grande obstáculo no tratamento, o desenvolvimento de resistência a fármacos. Existem vários mecanismos que têm vindo a ser associados com esta resistência à terapêutica, nomeadamente alterações genéticas e epigenéticas, desregulação dos transportadores de glucose e de efluxo e influxo de fármacos, alterações ao nível do alvo molecular, e a desregulação de vias de sinalização intracelulares de sobrevivência, de regulação do stresse oxidativo e da apoptose. Contudo, apesar do crescente conhecimento do mecanismo de resistência a fármacos em particular aos PIs, são necessários mais estudos na área da resistência aos IMiDs.O foco deste projeto foi avaliar os mecanismos moleculares de resistência a IMiDs, LEN e POM, in vitro, e averiguar o desenvolvimento de resistência cruzada ao Bortezomib (BTZ).Desta forma, foram desenvolvidas linhas resistentes a IMiDs por exposição contínua a LEN e POM, a partir das linhas sensíveis NCI-H929 e U-266 (resistentes à LEN, as células H929RL e U-266RL; resistentes à POM, as células U-266RP). A validação dos modelos de resistência e a avaliação de resistência cruzada ao PI foi avaliada através do ensaio de resazurina. As alterações genómicas foram avaliadas recorrendo ao Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification (MLPA). A expressão dos genes dos transportadores de efluxo da família ABC (ABCB1, ABC2 e ABCG2), dos transportadores de influxo (SLC2A1 e SLC2A11), do alvo principal dos IMiDs (CRBN), da via NF-κB (NFKB1 RELA, RELB, REL e IKBKB), da via KEAP1/NRF2 (KEAP1 e NFE2L2), de MYC, da proteína anti-apoptótica pertencente à família BCL-2 (BCL2) e de uma enzima metabolizadora de fármaco (NQO1) foi analisada por qPCR nas linhas celulares sensíveis e resistentes. A expressão proteica dos transportadores de efluxo, P-gp, MRP1 e BCRP, e do factor de transcrição NF-κB foi avaliada por citometria de fluxo recorrendo à marcação membranar e intracelular, respetivamente, com anticorpos conjugados com fluorocromos. A atividade dos transportadores foi também analisada por citometria de fluxo. Por fim, os níveis de espécies reativas de oxigénio foram avaliadas por fluorimetria com recurso às sondas fluorescentes. Os resultados foram analisados estatisticamente (nível de significância de 95%).Os resultados obtidos demonstram que os três modelos de resistência desenvolvidos apresentam diferentes graus de resistência de acordo com o IMiD e a linha celular em questão. Assim, as linhas celulares resistentes à LEN apresentaram valores de IC25 6,5 vezes e mais de 1470,6 vezes superiores ao estimado nas linhas sensíveis aos IMiDs (nas NCI-H929 o IC25 é de 65,8 µM e nas U-266 de 0,3 µM). De facto, nas células H929RL o IC25 é de é 427,3 µM e nas células U-266RL é ˃ 500,0 µM, evidenciando resistência à LEN. Na linha celular resistente a POM, as células U-266RP, apresentaram um IC25 de 390,0 µM ou seja cerca de 557,1 vezes superior ao calculado para a linha sensível U-266 (IC25=0,7 µM). Todos os modelos estudados resistentes aos IMiDs evidenciaram sensibilidade ao BTZ.Nas linhas resistentes observou-se um aumento na percentagem de células que expressam P-gp e MRP1 (P-gp: H929RL 52,7 ± 5,5 %; U-266RL 22,0 ± 2,0 % e U-266RP 24,3 ± 2,9 %; e MRP1: H929RL, 59,7 ± 0,6 %; U-266RL, 81,0 ± 2,0 % e U-266RP, 96,7 ± 0,6 %) comparativamente com as linhas sensíveis (P-gp: NCI-H929 5,0 ± 1,4 %; U-266 5,5 ± 0,7 %; e MRP1: NCI-H929 51,0 ± 2,8 %; U-266 77,0 ± 4,2 %). Adicionalmente, os estudos de expressão génica demonstraram um aumento da expressão dos genes SLC2A1, CRBN, RELA, RELB, KEAP1 e MYC, e diminuição da expressão génica de REL, NFE2L2, BCL2 e NQO1 nas linhas resistentes. Relativamente às alterações genómicas, as linhas resistentes apresentavam amplificações e deleções, sendo que a linha U-266RL foi a que apresentou mais alterações. Em suma, a resistência aos IMiDs nos três modelos de resistência desenvolvidos pode ser mediada pelo aumento da expressão da P-gp e MRP1. Além disso, as células resistentes aos IMiDs não apresentam resistência cruzada ao BTZ. Contudo, os resultados necessitam de ser validados através de uma análise molecular mais extensa.Multiple myeloma is a haematological malignancy characterized by the presence of abnormal clonal plasma cells in the bone marrow and by the presence of defining myeloma events. In MM treatment, the introduction of new pharmacological classes, such as Proteasome Inhibitors (PI), Immunomodulators (IMiDs) and Monoclonal Antibodies (mAbs), has been increasing the patients' survival. In combination with PI, different immunomodulators are currently used, such as Lenalidomide (LEN) and Pomalidomide (POM) in MM treatment which has cereblon as the main target. Nonetheless, this disease remains incurable, and resistance development is still a concern. Several mechanisms have been associated with resistance, including genetic alterations, glucose and drug efflux transporters dysregulation, alteration in molecular target, and dysregulation of intracellular signalling pathways of survival, oxidative stress and apoptosis.This project's focus was to evaluate the molecular mechanism underlying the IMiDs, LEN and POM, resistance in vitro and investigate the cross-resistance to Bortezomib (BTZ).Therefore, resistant cell lines to LEN and POM were developed from two in vitro cell models sensitive to these IMiDs, NCI-H929 and U-266, through continuous exposure to non-lethal doses. These resistant models were denominated according to the origin sensible cell line and the drug that they developed resistance to (LEN resistant cell lines: H929RL and U-266RL; POM resistant cell line: U-266RP). The three cell lines were maintained at their optimal growth conditions, which included the administration of 100 µM of LEN or POM. The effect of different drug concentrations, as well as the validation of resistant models and evaluation of cross-resistance to PI, were evaluated through the resazurin assay. Genomics alterations were evaluated using the MLPA assay. The gene expression of efflux transporters of the ABC family (ABCB1, ABC2 and ABCG2), of the solute transporters (SLC2A1 and SLC2A11), main IMiDs target (CRBN), of the NF-κB pathway (NFKB1 RELA, RELB, REL and IKBKB), of the KEAP1/NRF2 pathway (KEAP1 and NFE2L2), of the MYC, of the anti-apoptotic protein BCL2 (BCL2), and the metabolizing-drug enzyme (NQO1) were analysed by qPCR in sensitive and resistant cell lines. Besides that, protein expression of efflux transporters, P-gp, MRP1 and BCRP, and NF-κB was evaluated by flow cytometry using membrane and intracellular labelling, respectively, conjugated antibodies with fluorochrome. The activity of these transporters was also analysed by flow cytometry using Verapamil (P-gp inhibitor), MK-571 (MRP1/2 inhibitor) and Novobiocin (BCRP inhibitor). Lastly, the levels of intracellular peroxide, peroxide anion, nitric oxide, mitochondrial reactive oxygen species and reduced glutathione were evaluated using fluorescent probes by fluorometry, DCFH2-DA, DHE, DAF-FM, DHR-123 and MO. The results were analysed statistically (significance level of 95%).The three developed resistant models showed the IC25 values were 6.5 times (in H929RL cells is 427.3 µM), more than 1470.6 times (in U-266RL cells is ˃ 500 µM) and 557.1 times (U-266RP, 557.12 µM) higher than what was estimated for sensitive cell lines (in NCI-H929 cells is 65.78 µM; in U-266 cells is 0.34 µM). The resistant studied models to IMiDs exhibit sensitivity to BTZ, suggesting that there is no cross-resistance to this drug. The evaluation of the molecular mechanism associated with IMiDs resistance in the three developed models suggests that efflux transporters of the ABC family could have an important role since, to P-gp and MRP1, there were more positive cells (P-gp: H929RL 52.7 ± 5.5 %; U-266RL 22.0 ± 2.0 % e U-266RP 24.3 ± 2.9 %; and MRP1: H929RL, 59.7 ± 0.6 %; U-266RL, 81.0 ± 2.0 % e U-266RP, 96.7 ± 0.6% ) than in sensitive cell lines (P-gp: NCI-H929 5.0 ± 1.4 %; U-266 5.5 ± 0.7 %; e MRP1: NCI-H929 51.0 ± 2.8 %; U-266 77.0 ± 4.2). Relative to gene and protein expression of these three transporters, there were no observed coherent differences between the resistant models to the same drug. Besides that, the gene expression results showed an increase in SLC2A1, CRBN, RELA, RELB, KEAP1 e MYC genes, and a decrease in gene expression of REL, NFE2L2, BCL2 and NQO1 in resistant cell lines. Relative to genomics alterations, the resistant cell lines exhibit the presence of amplification and deletions genes, and U-266RL present more alterations. In short, the resistant cell lines to LEN and POM do not present cross-resistance to BTZ. Besides that, the increase in efflux transporters at the surfacing of cells, namely P-gp and MRP1, can be related to the IMiDs resistance. Therefore, the modulation of these transporters can contribute to overcoming the IMiDs resistance. The rest of the results should be posteriorly verified through extensive molecular analysis.2023-02-272029-02-25T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesishttp://hdl.handle.net/10316/105978http://hdl.handle.net/10316/105978TID:203249844engAlmeida, Ana Sofia Abrantes deinfo:eu-repo/semantics/embargoedAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2023-10-27T11:13:04Zoai:estudogeral.uc.pt:10316/105978Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T21:22:27.385611Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse |
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