RNA-seq analysis to unravel the molecular players involved in implantation/ rejection of human tumor cells in zebrafish

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Domingues, Micaela Oliveira
Data de Publicação: 2020
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: eng
Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
Texto Completo: http://hdl.handle.net/10451/47904
Resumo: Tese de mestrado em Bioinformática e Biologia Computacional, Faculdade de Ciências, Universidade de Lisboa, 2020
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spelling RNA-seq analysis to unravel the molecular players involved in implantation/ rejection of human tumor cells in zebrafishPeixe-zebraMicroambiente tumoralTumorrna-seqSistema imune inatoTeses de mestrado - 2020Domínio/Área Científica::Ciências Naturais::Ciências BiológicasTese de mestrado em Bioinformática e Biologia Computacional, Faculdade de Ciências, Universidade de Lisboa, 2020Nos últimos anos, a imunoterapia surgiu como um tratamento promissor ao cancro. No entanto, nem todos os doentes respondem com sucesso a essa terapia. O problema poderá residir noutros mecanismos imuno-supressores presentes no microambiente tumoral. Rita Fior e colegas, identificaram um par de linhas celulares de cancro colorectal humano derivadas do mesmo paciente (SW480 primário versus metástase linfonodal - SW620), que apresentam comportamentos contrastantes quando transplantadas para peixe-zebra. Enquanto que as SW480 são rejeitadas pelo sistema imune inato do peixe zebra, as SW620 implantam de uma forma muito eficiente. De modo a descobrir os mecanismos moleculares envolvidos na rejeição/ implantação destas células, os tumores foram dissecados e enviados para sequenciação de mRNA (mRNA-seq). O presente trabalho focou-se na análise e comparação dos dados de mRNA destes tumores. Uma vez que as nossas amostras de RNA contêm RNA humano (células tumorais) e de peixe-zebra, um dos grandes desafios foi evitar mapear as reads ao genoma errado. Desta forma, decidimos comparar o desempenho de dois métodos de alinhamento e contagem de reads diferente. Escolhemos um método que inclui a dupla HISAT2 com featureCounts. O HISAT2 produz um alinhamento clássico e featureCounts, conta as reads atribuídas a um certo gene. O outro método é o Salmon, que produz um "pseudo-alinhamento" e que estima as contagens das reads. Em ambos os métodos duas alternativas foram usadas, numa usou-se o genoma / transcriptoma humano e noutra um genoma / transcriptoma “híbrido”, isto é, a combinação do genoma / transcriptoma humano com o do peixe-zebra. Grupos de genes com expressão diferencial entre os dois tipos de “xenografts” SW480 e SW620 foram identificados e foi feita a análise de enriquecimento funcional. A abordagem feita pelo Salmon parece discriminar melhor as hipóteses alternativas que explicam o fenómeno de implantação/rejeição das células tumorais. Estes resultados suportam a existência de uma conversa cruzada entre as células tumorais e o microambiente tumoral. Descobrimos que os genes diferencialmente expressos estão principalmente enriquecidos em três processos biológicos em ambos os grupos: resposta imune, metabolismo e sinalização. Enquanto que os xeno-enxertos de SW480 estão enriquecidos em categorias funcionais envolvidas na transição epitélio-mesenquimal (EMT), por outro lado, os xeno-enxertos de SW620 estão especialmente enriquecidos em processos como proliferação e hipóxia / angiogénese. Também várias vias de sinalização relacionadas com o sistema imune, em particular a doença do enxerto contra o hospedeiro, sinalização de IL6 e vias de rejeição de xeno-enxertos, estão enriquecidas nos tumores de SW480. Em contraste, os “xenografts” de SW620 são caracterizados por um enriquecimento na via de sinalização de ROS, bem como na sinalização de NOTCH. Estes resultados sugerem que os tumores SW480 realmente expressam sinais que estimulam a “clearance”, enquanto que os tumores SW620 não parecem expressar vias relacionadas à rejeição. Além disso, construímos duas redes com o geneMANIA para prever interações entre os genes diferencialmente expressos dos tumores SW480 e outros 70 genes relacionados, e uma segunda rede para prever as interações entre os tumores SW620 e 60 genes adicionais. Em seguida, submetemos cada grupo de genes no ClueGO. A nossa análise também sugere que as células tumorais SW620 poderão estar a conseguir escapar à vigilância imunológica, através de processos complexos, como desgranulação das plaquetas e coagulação, que poderão favorecer a proteção das células cancerígenas contra o reconhecimento e ação do sistema imunitário. Também as metalotioneínas (MTs), que parecem ter múltiplas funções no cancro, em concerto com a polarização dos macrófagos em direção a um fenótipo M2 pró-tumoral poderão desempenhar um papel na evasão tumoral, resultando no desenvolvimento tumoral. Estes genes diferencialmente expressos que foram descobertos nesta análise irão ser estudados por ensaios de perda e ganho de função de forma a determinar a sua relevância para os fenótipos de implantação/rejeição tumoral. A descoberta destes novos mecanismos de implantação/rejeição tumoral poderá no futuro dar origem a novas terapias e novas descobertas sobre evasão tumoral.Over the last few years, immunotherapy has emerged as a very promising cancer treatment. However, not all patients successfully respond to this therapy. This problem may reside in other suppressor mechanisms present in the tumor microenvironment. Fior and colleagues, identified a pair of human colorectal cancer cell lines derived from the same patient (primary-SW480 vs lymph-node metastasis SW620), with contrasting engraftment /clearance behaviors in zebrafish xenografts. The results suggest that some human cancer cells are cleared from the host (regressors), while others can evade/suppress innate immunity (progressors). To discover the molecular mechanisms involved in this tumor-host interaction, we did an unbiased mRNA transcriptome comparative analysis (mRNA-seq) between SW480 and SW620 xenografts. The focus of this work was to perform a differential expression analysis of these tumors. Since our RNA samples contain both human and zebrafish RNA, one of the biggest challenges was to avoid mapping reads to the wrong genome. So, we have decided to use two different methods to map and count the reads. We chose a method that includesthe duo HISAT2 with featureCounts. HISAT2 produces a classic alignment and featureCounts, counts reads assigned to a gene. The other method is Salmon, which produces a “pseudo-alignment” and estimates transcript abundance. In both methods, two options were used, one applying the human genome / transcriptome and the other a “hybrid” genome / transcriptome, the combination of the human and zebrafish genome / transcriptome. Differentially expressed genes (DEGs) between SW480 and SW620 xenografts were identified and functional enrichment analysis was performed. Salmon's approach seemed to better highlight the alternative hypothesis that explain the tumor cell implantation / rejection phenotype. Our results support a crosstalk between tumor cells and the tumor microenvironment (TME) in both xenografts. We found that DEGs were enriched mainly in three biological process in both groups: immune response, metabolism and signaling. Pre-rank gene set enrichment analysis (GSEA) revealed that SW480 xenografts are enriched in functional categories involved in Epithelial to Mesenchymal Transition (EMT) and SW620 xenografts are specially enriched in proliferation and hypoxia/angiogenesis. We also identified several immune related pathways, in particular, graft-versus host disease, IL6 signaling and allograft rejection pathways enriched in SW480 xenografts. In contrast, SW620 xenografts were characterized by an enrichment in ROS pathway as well as NOTCH signaling. These results suggest that SW480 tumors may express signals that stimulate clearance, while SW620 tumors do not express rejection-related pathways. Additionally, two networks were constructed with geneMANIA to predict interactions between the SW480 DEGs and additional 70 related genes, and a second network to predict the interactions between SW620 and 60 additional genes. Next, we submitted each group of genes to ClueGO and showed that SW480 xenografts apparently generate a more effective immune surveillance system, which may involve immune cells such as NK cells and granulocytes (neutrophils). In SW620 tumors, the genes/pathways that emerge, point to mechanisms of immune escape, through intricated processes like platelet degranulation and coagulation. Also, metallothioneins emerge as major players in SW620 xenografts. These molecules appear to have multiple functions in cancer, and, in concert with the polarization of macrophage towards a pro-tumoral M2 phenotype, may possibly contribute to immune evasion and tumorigenesis. The DEGs found in this analysis will be tested by loss and gain of function experiments to determine their relevance for tumor implantation / rejection phenotypes. The discovery of these new tumor implantation / rejection mechanisms can possibly be used in the future to find new therapeutics to enhance immunotherapy.Fior, RitaCarvalho, Margarida GamaRepositório da Universidade de LisboaDomingues, Micaela Oliveira2021-05-14T17:12:10Z202020202020-01-01T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/47904TID:202596559engmetadata only accessinfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2023-11-08T16:51:03Zoai:repositorio.ul.pt:10451/47904Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T21:59:49.936264Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse
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