Diagnosis, Prognosis and Personalized Treatment of Cystic Fibrosis
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| Data de Publicação: | 2018 |
| Tipo de documento: | Dissertação |
| Idioma: | eng |
| Título da fonte: | Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) |
| Texto Completo: | http://hdl.handle.net/10451/36482 |
Resumo: | Tese de mestrado, Bioquímica (Bioquímica Médica) Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2018 |
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Diagnosis, Prognosis and Personalized Treatment of Cystic FibrosisFibrose QuísticaCFTRMutações órfãsMedicina personalizadaModuladores da CFTRTeses de mestrado - 2018Departamento de Química e BioquímicaTese de mestrado, Bioquímica (Bioquímica Médica) Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2018Cystic Fibrosis (CF) is the most common lethal autosomal recessive genetic disorder in Caucasian populations. CF is caused by over 2000 mutations in the Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator (CFTR) gene, that encodes a cAMP-activated and phosphorylation-regulated chloride (Cl-) and bicarbonate (HCO3-) channel expressed at the apical membrane of epithelial cells. Malfunction of mutant CFTR leads to dysregulation of ion and fluid homeostasis across several epithelia, resulting in dehydration and obstruction of ducts, atrophic epithelia, gland hypertrophy, inflammation and tissue fibrosis. The airways disease, characterized by an impaired mucociliary clearance and recurrent cycles of infection, inflammation and scarring, that cause progressive loss of lung function, remains the major cause of morbidity and mortality among CF patients. A classification system of CFTR mutations according to the respective functional defect elicited on the CFTR protein has been proposed and these classes (I-VII) have been evolving as theratypes, i.e., groups of mutations that are expected to be rescued by the same therapeutic strategy. Small-molecule drugs have recently been approved for treatment of CF patients carrying selected mutations, namely VX-770 (or ivacaftor, marketed as Kalydeco®), a potentiator of the CFTR channel, and combinations of this potentiator with correctors of the folding/ trafficking defects of the most frequent mutant (F508del-CFTR), namely VX-809 (lumacaftor, which in combination with ivacaftor is known as Orkambi®) and VX-661 (tezacaftor, known as Symdeco® when combined with ivacaftor). However, for patients carrying orphan mutations – very rare and un- or mischaracterized variants – it is unknown whether they can benefit from already approved therapies and it is unlikely that further therapeutic efforts will be made towards correction of these mutants. Against this background and given the fact that CF severity is also partially dependent on other non-CFTR related genetic modifiers and non-genetic factors such as environmental determinants, patient-personalized approaches are becoming the gold standard for CF diagnosis, prognosis and therapeutic advice. In this MSc project, we first aimed to assess CFTR function in native tissues and primary cultures from CF/CF-suspicion patients carrying different (rare) mutations through (i) Ussing chamber measurements of CFTR-mediated Cl- secretion in rectal biopsies, (ii) Forskolin(Fsk)-induced swelling (FIS) assays of 3D-intestinal organoids derived from these biopsies and (iii) Ussing chamber measurements in isolated human nasal epithelial cells (HNECs) to establish a CF diagnosis and possible prognosis for the studied patients. Our second goal was to repurpose the approved CFTR modulator drugs by testing them in the patient-derived primary cultures and using the above approaches to assess CFTR rescue after incubation with these drugs. Finally, we aimed to identify which among the CFTR function parameters used provide the best correlations with CF-relevant outcomes from patients, so as to further establish them as robust biomarkers for CF diagnosis, prognosis and personalized treatment. We were able to support a diagnosis for 25/26 studied patients, with 14 being CF (mild) (i.e., with residual CFTR function) and 8 being CF (severe) (i.e., no residual CFTR function). For the remainder 3 patients, a non-CF diagnosis was proposed due to detection of high levels of Cl- secretion and presentation of a normal or inconclusive clinical phenotype. We were also able to detect rescue of CFTR function by at least one of the current CF-approved drugs, with potential for clinical benefit, for 7/13 patients’ samples assessed, some of which carry mutations outside of the approved drug labels (e.g. S955P). In the end, the cAMP and cholinergic co-activated CFTR-mediated current measured in rectal biopsies correlated best with donor-matched CFTR-dependent organoid swelling at 0.8 μM Fsk, and both these parameters also correlated strongly with more established CF biomarkers, namely the sweat chloride and fecal elastase E1 values. Overall, our results further validate the use of CFTR function measurements in rectal biopsies and 3D-intestinal organoids as personalized predictive tools for CF.A Fibrose Quística (FQ) é a doença autossómica recessiva letal mais comum em populações de origem Caucasiana, e afeta cerca de 85.000 pessoas em todo o mundo. Esta doença é causada por mais de 2000 mutações no gene CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator), que codifica para um canal de cloreto (Cl-) e bicarbonato (HCO3-) expresso na membrana apical das células epiteliais e que é ativado pelo cAMP e regulado por fosforilação. A CFTR atua também na regulação de outros canais epiteliais como o canal epitelial de sódio (Na+) ENaC (Epithelial sodium channel). A disfunção da proteína CFTR leva à desregulação da homeostase iónica e hídrica em vários tecidos epiteliais, resultando na desidratação e obstrução de ductos, atrofia epitelial, hipertrofia de glândulas, inflamação crónica e fibrose dos tecidos. No caso particular das vias respiratórias, a deficiente secreção de Cl- pela CFTR e a hiperabsorção de Na+ pela ENaC leva à desidratação do líquido que reveste as superfícies respiratórias, aumentando a viscosidade das secreções e comprometendo o mecanismo de limpeza mucociliar, levando à mucoestase. Isto resulta em colonizações bacterianas recorrentes, obstrução das vias áereas, inflamação crónica e deterioração do tecido, que levam à perda progressiva da função pulmonar, que continua a ser a maior causa de morbilidade e mortalidade para os pacientes com FQ. O elevado número de mutações descritas no gene CFTR tem sido categorizado com base no respetivo defeito funcional causado ao nível da proteína em sete classes, numeradas de I-VII, que têm evoluído para teratipos, i.e., conjuntos de mutações que poderão ser corrigidas pela mesma estratégia terapêutica. Mutações de classe I originam tipicamente um codão stop prematuro no mRNA do CFTR, levando à sua degradação e à redução da expressão duma variante truncada da proteína CFTR; mutações de classe II resultam num defeito do enrolamento tridimensional da proteína (misfolding), levando à sua retenção e degradação no retículo endoplasmático, resultando na sua ausência na membrana apical; mutações de classe III interferem com a regulação do canal da CFTR, reduzindo drasticamente a sua probabilidade de abertura e transporte de iões; mutações de classe IV levam a constrangimentos no poro do canal com a consequente redução da respetiva condutância; mutações de classe V são tipicamente associadas a mecanismos de splicing alternativo que levam à produção de transcritos normais e aberrantes do gene CFTR em diferentes rácios, levando a uma significativa redução dos níveis de proteína normal; mutações de classe VI desestabilizam a CFTR na membrana plasmática, reduzindo assim sua função; mutações de classe VII são chamadas de “irrecuperáveis”, uma vez que causam defeitos tão significativos no CFTR que não podem ser farmacologicamente corrigidos, como, por exemplo, grandes deleções do gene. Estas últimas resultam na ausência de transcritos do CFTR e consequentemente não existe qualquer expressão da proteína. Recentemente, foram desenvolvidas e aprovadas pequenas moléculas para o tratamento de pacientes com FQ que possuem mutações específicas no CFTR, nomeadamente o VX-770 (ou ivacaftor), um potenciador da CFTR que leva ao aumento da probabilidade de abertura do canal, e tratamentos combinatórios deste potenciador com as moléculas VX-809 (ou lumacaftor) ou VX-661 (ou tezacaftor), corretoras de defeitos do tráfego do canal. Estes medicamentos estão comercializados como Kalydeco® (VX-770), Orkambi® (VX-809/770) e Symdeco® (VX-661/770), respetivamente. No entanto, para pacientes que possuem mutações órfãs – mutações raras cujo defeito funcional causado na CFTR é indefinido ou está mal caracterizado – ainda não se sabe se poderão beneficiar das terapias já aprovadas. Além disso, não é expectável que venham a ser desenvolvidos esforços direcionados para o desenvolvimento de terapias específicas para estas mutações, devido ao baixo número de pacientes que as expressam, associado à sua elevada distribuição geográfica. Dado isto, e o facto de que a gravidade da FQ é também parcialmente dependente doutros fatores genéticos não associados ao CFTR (p.ex., genes modificadores) e fatores não-genéticos (p.ex., ambientais), as abordagens personalizadas ao paciente individual, que têm em conta além do genótipo do CFTR e do defeito funcional que é causado na proteína, têm-se tornado no padrão-ouro para o diagnóstico, prognóstico e aconselhamento terapêutico da FQ. Um conjunto de metodologias inovadoras têm vindo a ser desenvolvidas na área da FQ, permitindo a análise laboratorial de células/tecidos derivados do próprio paciente para seleção pré-clínica de pacientes que respondam positivamente a tratamentos já aprovados. O primeiro objetivo deste projeto de Mestrado foi avaliar a função da CFTR em tecidos nativos e culturas primárias de pacientes com FQ ou suspeita de FQ, apresentando diferentes mutações no gene CFTR, com principal foco em pacientes com mutações raras ou ultra-raras. Isto foi realizado através de (i) medições electrofisiológicas da secreção de Cl- mediada pela CFTR em biópsias rectais de pacientes usando a câmara de Ussing, (ii) ensaios do inchamento induzido por Forscolina (FIS – Forskolin(Fsk)-induced swelling), um ativador da CFTR que atua no aumento dos níveis intracelulares de cAMP, em culturas primárias de organóides intestinais 3D derivados destas biopsias rectais e (iii) medições electrofisiológicas da atividade da CFTR em culturas primárias de células epiteliais nasais isoladas dos pacientes, usando também a câmara de Ussing, a fim de estabelecermos um diagnóstico e possível prognóstico de FQ para os pacientes estudados. O nosso segundo objetivo foi reaproveitar os fármacos já aprovados para a correção de defeitos na CFTR, testando-os nas culturas primárias dos pacientes e usando novamente as metodologias supramencionadas para avaliar o resgate da função da CFTR após incubação com estas moléculas. Através disto, pretendíamos determinar qual a melhor terapia para cada paciente, de uma forma personalizada, bem como identificar mutações órfãs que respondessem positivamente aos tratamentos já aprovados. Finalmente, o nosso último objetivo foi identificar qual/quais de entre os parâmetros de avaliação da função da CFTR usados correlacionaria melhor com os resultados clínicos dos pacientes, permitindo validá-lo(s) como biomarcadores robustos para o diagnóstico, prognóstico e tratamento personalizado da FQ. Através da nossa análise pudemos apoiar um diagnóstico para 25/26 pacientes estudados, tendo classificado 14 como pacientes com FQ não-clássica (i.e., com função residual da CFTR) e 8 com FQ clássica/severa (i.e., sem função da CFTR). Para os restantes 3 pacientes, propusemos a exclusão de um diagnóstico de FQ, devido à detecção de níveis elevados de secreção de Cl- mediada pela CFTR nas suas biópsias rectais (i.e., função normal), a par de uma apresentação clínica não sugestiva de FQ. A análise por FIS dos organóides intestinais 3D dos pacientes, após incubação com os fármacos aprovados para a correção de disfunções da CFTR mutada, permitiu determinar a ocorrência do resgate da função da CFTR por pelo menos um desses fármacos (VX-770, VX-809/770 ou VX-661/770), com baixo, médio ou elevado potencial para benefício clínico, para 7/13 pacientes analisados, permitindo o reaproveitamento destas terapias para estes pacientes, alguns dos quais possuem mutações para as quais os fármacos não estão (ainda) aprovados (p.ex., S955P). Por fim, os nossos resultados da análise de correlações entre os parâmetros da função da CFTR usados neste projecto, mostraram ser a corrente dependente da CFTR, co-activada pelo cAMP e estímulos colinérgicos, detetada na análise de biópsias rectais em câmara de Ussing, o parâmetro que melhor se correlaciona com o inchamento dependente da CFTR dos organóides intestinais 3D, induzido por uma concentração de Fsk de 0.8 μM. Além disso, estes dois parâmetros funcionais também correlacionaram mais significativamente com outros biomarcadores de FQ melhor estabelecidos na área, nomeadamente as concentrações de Cl- no suor e os valores de elastase fecal E1. Globalmente, os nossos resultados validam o uso das medições da função da CFTR em biópsias rectais e organóides intestinais 3D como ferramentas personalizadas preditivas para a FQ.Amaral, Margarida, 1958-Kunzelmann, KarlRepositório da Universidade de LisboaCenteio, Raquel Martins2020-10-29T01:30:15Z201820182018-01-01T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/36482TID:202188701enginfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2023-11-08T16:33:13Zoai:repositorio.ul.pt:10451/36482Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T21:50:48.052382Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse |
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