Heterologous expression of human KRASwt cDNA in Saccharomyces cerevisiae and its mutants from the Ras signalling pathway and phenotype screening

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Carneiro, Eliana Raquel Dias
Data de Publicação: 2015
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: eng
Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
Texto Completo: http://hdl.handle.net/1822/35689
Resumo: Dissertação de mestrado em Genética Molecular
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spelling Heterologous expression of human KRASwt cDNA in Saccharomyces cerevisiae and its mutants from the Ras signalling pathway and phenotype screening577.21582.282.23Ciências Naturais::Ciências BiológicasDissertação de mestrado em Genética MolecularMost of our knowledge about basic cellular processes has originated from model organisms. Saccharomyces cerevisiae is consider a model system, representing the simplest eukaryotic organism, whose genome can be easily manipulated allowing suitable analysis and efficient assessment of gene products from humans. RAS genes encode low molecular weight, GTP-binding, GTP-hydrolysing proteins that are highly conserved throughout all eukaryotic species. RAS pathway has attracted attention because of its importance in malignant transformation of human cells. KRAS is a human RAS isoform, expressed in almost all cell types and essential for the normal cellular development, in addition it is the isoform most frequently mutated in many cancer types. The S. cerevisiae has two RAS genes, RAS1 and RAS2 that are essential, once their double deletion renders yeast unviable. These genes are structurally and functionally homolog of the mammalian RAS proto-oncogenes. This conservation allows the use of yeast genetics to the study of KRAS. Considering this, the first aim of this work was to build a set of S. cerevisiae strains (using haploid BY4741 wild type, ras1Δ, and ras2Δ as a basis) expressing the human KRASwt cDNA, using a plasmid-based expression. The second aim was the phenotype screening of these humanized yeasts, as well as of the correspondent recipient strains. The effect of KRASwt expression was evaluate on the cell stress response, growth, chronological aging, cell cycle progression and haploid invasive growth. According to the results, the KRASwt heterologous expression in yeast (1) had a negative or null effect on the resistance to the temperature, pH, osmotic and oxidative stresses; (2) decreased growth on non-fermentable carbon sources; (3) increased the adhesion capacity; (4) stimulated the haploid invasive growth in the ras2Δ strain; (5) modified the budding pattern of the wild type cells; (6) changed the cellular proliferation in a strain-dependent way; and (7) decreased the chronological lifespan. The results indicated that the expression of KRASwt in the wild type strain, possibly leads to a hyperactivaction of the RAS/cAMP/PKA signalling pathway, which in turn triggers a decrease of stress resistance and longevity. This study also highlighted the relevance of the yeast background, to the possible achievement of different results, regardless the functional conditions used. The present work contributed to gain insight into KRAS mechanism of action using yeast as a model organism. Furthermore, all obtained results will constitute part of the development of a yeast-based high throughput phenotype platform for future pharmacological testing.Grande parte do nosso conhecimento acerca dos processos celulares fundamentais provêm de organismos modelo. A levedura Saccharomyces cerevisiae é considerada um sistema modelo, representando um organismo eucariota simples, cujo genoma pode ser facilmente manipulado, permitindo uma análise adequada e uma avaliação eficiente das proteínas humanas. Os genes RAS codificam proteínas de baixo peso molecular, de ligação e hidrólise de GTP, que estão amplamente conservadas em todas as espécies eucariótas. O estudo da via RAS tem atraído a atenção devido à sua importância na transformação maligna das células humanas. O KRAS é uma das isoformas RAS humanas, expressa em quase todos os tipos de células e essencial para o normal desenvolvimento celular, para além disso, é também a isoforma que se encontra frequentemente mutada em diversos tipos de cancro. S. cerevisiae tem dois genes RAS, RAS1 e RAS2, essenciais uma vez que a sua dupla deleção é letal para a levedura. Estes genes são estruturalmente e funcionalmente homólogos dos proto-oncogenes RAS dos mamíferos. Esta conservação permite a utilização da levedura para o estudo do KRAS. Deste modo, o primeiro objectivo deste trabalho foi construir um conjunto de estirpes de S. cerevisiae (BY4741 haplóide wild type, ras1Δ e ras2Δ como receptoras) a expressar o KRASwt humano, usando um plasmídeo de expressão. O segundo objectivo foi a realização de um screening fenotípico das leveduras humanizadas, bem como das estirpes não transformadas. O efeito da expressão do KRASwt foi avaliado na resposta ao stress celular, crescimento, envelhecimento cronológico, progressão do ciclo celular e no crescimento invasivo haplóide. De acordo com os resultados, a expressão heteróloga do KRASwt na levedura (1) teve um efeito negativo, ou nulo, na resistência aos diferentes stresses (temperatura, pH, osmótico e oxidativo); (2) reduziu o crescimento em fontes de carbono não fermentáveis; (3) aumentou a capacidade de adesão; (4) estimulou o crescimento invasivo haplóide na estirpe ras2Δ; (5) modificou o padrão de divisão das células wild-type; (6) alterou a proliferação celular; e (7) diminuiu a longevidade cronológica. Os resultados indicaram que a expressão do KRASwt na estirpe wild type, levou a uma possível hiperativação da via de sinalização RAS/cAMP/PKA, responsável pela diminuição da resistência ao stress e da longevidade. Este estudo também demonstrou a relevância do background da levedura para a possível obtenção de diferentes resultados, independentemente das condições usadas. O presente trabalho contribuiu para o conhecimento do mecanismo de ação do KRAS através da utilização da levedura como organismo modelo. Além disso, todos os resultados obtidos farão parte de uma plataforma de fenótipos de levedura para futuros testes farmacológicos.Lucas, CândidaFerreira, CéliaUniversidade do MinhoCarneiro, Eliana Raquel Dias20152015-01-01T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/1822/35689eng201257599info:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2023-07-21T12:12:30Zoai:repositorium.sdum.uminho.pt:1822/35689Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T19:04:25.897623Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse
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