Thioredoxin reductase inhibitors as potential antitumorals: mercury compounds efficacy in glioma cells

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Pires, Vanessa Sofia Amaral
Data de Publicação: 2019
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: eng
Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
Texto Completo: http://hdl.handle.net/10451/43688
Resumo: Tese de mestrado, Ciências Biofarmacêuticas, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia, 2019
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spelling Thioredoxin reductase inhibitors as potential antitumorals: mercury compounds efficacy in glioma cellsGlioblastomaThioredoxin reductaseThioredoxinEthylmercuryThimerosalTeses de mestrado - 2019Domínio/Área Científica::Ciências Médicas::Ciências da SaúdeTese de mestrado, Ciências Biofarmacêuticas, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia, 2019The glioblastoma multiforme (GBM) is the most aggressive and common form of glioma. GBM, as many other tumors, present high levels of redox proteins, which is linked to therapy resistance. Therefore, targeting of redox active systems is becoming increasingly more important in chemotherapy, since cancer cells, due to the greater basal levels of reactive oxygen species (ROS), present a higher vulnerability to oxidative stress than non-cancer cells. One of the major redox systems is the thioredoxin system, which comprises thioredoxin (Trx), the selenoenzyme thioredoxin reductase (TrxR) and nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADPH). This system regulates important functions for cancer cells such as DNA synthesis, regulation of transcription factors and reduction of ROS. Also it has an important anti-apoptotic role and therefore inhibition of TrxR and Trx may lead to cell death. Among the main inhibitors of the thioredoxin system, mercury compounds were found to be the most effective. Indeed, mercury presents a high affinity for binding to thiols and selenols, leading to a rapid loss of activity of Trx and especially TrxR. Moreover, mercury compounds can effectively cross the blood-brain barrier (BBB) exerting neurotoxicity, which could facilitate their use for GBM treatment. Therefore, this study aims to evaluate the toxicity of two mercury compounds, ethylmercury (EtHg) and thimerosal (TM) in a mouse glioma cell line (GL261), its relation with the inhibition of the thioredoxin system and the occurrence of oxidative stress. Moreover, insight is provided on the possibility of using these compounds to improve the efficacy of the treatment with temozolomide (TMZ). The results showed that GL261 cells are very sensitive to mercury compounds, with an IC50 for both compounds of approximately 2.5 µM after 24 h of exposure. This was related with a strong inhibition of TrxR (IC50 of 0.8 and 0.7 µM for EtHg and TM, respectively), which supports the notion that this enzyme is a preferential target of these compounds. In agreement, a strong oxidation of both Trx isoforms (cytosolic and mitochondrial) was observed. This oxidation was linked to an increase in ROS levels (50% for 5 µM for EtHg and TM) and was reflected in higher dimerization of Prx2 (20-40%), which is an enzyme downstream of Trx. Also, an increase in Caspase-3 like activity up to 20-50% suggests that apoptosis may be involved in the toxicity of these mercury compounds. Most importantly, co-exposure of GL261 cells to TMZ, a compound commonly used in GBM therapy, and mercury compounds resulted in increased cytotoxicity of the former. Overall, these results showed that Hg compounds, namely EtHg and TM, are potential therapeutic agents to be used in GBM therapy since they target the redox capability of cells at very low exposure levels, enhancing the cytotoxicity of other compounds such as TMZ. Also, these results stress the importance of targeting redox active systems to improve efficacy of GBM therapy.O glioblastoma multiforme (GBM) é a forma mais agressiva e comum de glioma, sendo este considerado um glioma de grau IV pela Organização Mundial de Saúde (OMS). As células de GBM têm morfologia variável e apresentam um elevado potencial proliferativo e migratório. O tratamento deste cancro inclui ressecção cirúrgica, radioterapia e quimioterapia com fármacos como a temozolamida (TMZ). A TMZ é uma molécula lipofílica, com capacidade de atravessar a barreira hematoencefálica atuando no sistema nervoso central (SNC). A resistência à terapia com a temozolamida é altamente predominante e deve-se a fatores como a sobre-expressão de metiltransferases, ativação dos mecanismos de reparação do DNA e à sobre-expressão de sistemas redox, como os sistemas da glutationa e da tiorredoxina. Tal facto resulta das células cancerígenas terem níveis basais de espécies reativas de oxigénio (ROS) mais elevados. Como tal, as células cancerígenas apresentam maior vulnerabilidade a uma alteração do equilíbrio redox e, neste sentido, a inibição dos sistemas da glutationa e da tiorredoxina surge como uma abordagem terapêutica importante. O sistema da tiorredoxina é composto pela tiorredoxina (Trx), pela selenoenzima tiorredoxina redutase (TrxR) e fosfato de dinucleotídeo de nicotinamida adenina (NADPH) que funciona como o dador de eletrões para o sistema. A Trx é uma enzima que no estado reduzido contém um ditiol [(SH)2] no centro ativo que permite a transferência de eletrões para reduzir tióis (SH) em várias enzimas. Neste processo, o ditiol da Trx é oxidado a dissulfeto (S-S) sendo necessária a ação da TrxR para retornar à forma reduzida. A TrxR tem um resíduo de selenocisteína no centro ativo que graças ao baixo pKa do selenol (SeH) é bastante reativo. De entre as principais funções reguladas por este sistema e que têm impacto a nível da biologia tumoral encontram-se: 1) a regulação da atividade da ribonucleótido reductase e consequentemente da síntese de DNA; 2) a regulação da atividade de fatores transcrição e sinalização celular; 3) a redução das peroxirredoxinas que são importantes na regulação dos níveis de ROS; 4) a inibição da ASK-1, uma MAPKKK reguladora de apoptose. Como tal, a inibição do sistema da tiorredoxina compromete várias funções vitais às células tumorais, levando à inibição da sua proliferação e eventualmente à morte. Os compostos de mercúrio por apresentarem uma elevada afinidade para ligação a tióis e selenóis, estão entre os inibidores mais eficientes do sistema de tiorredoxina e em particular da TrxR. Além disso, os compostos de mercúrio podem efetivamente atravessar a barreira hematoencefálica, causando neurotoxicidade, o que os torna compostos com potencial interesse para serem usados na terapia de glioblastoma ou como um complemento na quimioterapia com TMZ. Neste contexto, o timerosal (TM), um tiossalicilato de etilmercúrio, surge como um composto de eleição, uma vez que já possui histórico de uso humano, como conservante em vacinas. De assinalar que o TM é uma pró-droga que liberta etilmercúrio (EtHg) sendo este o composto ativo. O objetivo deste trabalho foi avaliar a toxicidade do EtHg e do TM e a sua relação com a inibição do sistema de tiorredoxina, como também a ocorrência de stress oxidativo que conduza à morte celular. Além disso, foi avaliada a possibilidade de usar estes compostos para melhorar a eficácia do tratamento com TMZ. O modelo celular utilizado foram células de glioblastoma de ratinho, GL261 que possuem as principais características da maioria dos modelos de glioma, i.e. elevada taxa de proliferação, com crescimento evasivo não-metastático e mutações pontuais nos genes p53 e K-Ras. Os resultados mostraram que as células GL261 são muito sensíveis aos compostos de mercúrio, apresentando um IC50 de aproximadamente 2.5 µM para ambos os compostos de mercúrio. Com apenas 1 µM de EtHg e TM após 24 h de exposição, observou-se uma inibição tanto da TrxR como da Trx, verificando-se que estes compostos afetam particularmente a TrxR (IC50 de 0,8 e 0,7 µM para EtHg e TM, respetivamente). Observou-se igualmente um decréscimo mais pronunciado da expressão da TrxR, o que poderá sugerir que ambos os compostos interferem com via de sinalização do Nrf-2 levando a uma diminuição na síntese da TrxR1. Com vista a estudar com maior detalhe o modo como o EtHg e TM afetam o sistema da tiorredoxina, mediu-se a atividade da TrxR e Trx nas frações citosólica (TrxR1, Trx1) e mitocondrial (TrxR2, Trx2). No geral, observou-se que apesar de ambas as frações serem afetadas, a fração citosólica foi a que sofreu uma maior inibição das atividades tanto da TrxR como da Trx após a exposição a EtHg. O TM mostrou ser mais tóxico para a atividade da fração mitocondrial de ambas as enzimas. A oxidação das cisteínas da Trx citosólica e mitocondrial foi notória após a exposição a ambos os compostos. No caso da Trx citosólica, tal oxidação teve reflexos a jusante ocorrendo dimerização da Prx2 (20-40%), bem como um aumento da acumulação de ROS (50% para 5 µM para EtHg e TM) o que evidencia stress oxidativo. Para além disso, a exposição a concentrações crescentes de EtHg e TM induziu um aumento na atividade da enzima caspase-3 (20-50%), sugerindo que a apoptose pode ser uma das vias de morte celular que resulta da toxicidade deste compostos. A avaliação do efeito da co-exposição das GL261 aos compostos de mercúrio e a TMZ aumentou a eficácia terapêutica desta. Com efeito, a co-exposição a TMZ 200 µM e 1-2 µM de EtHg/TM mostrou uma inibição da proliferação celular superior a 50% a partir das 48 h, enquanto que com apenas a TMZ (200 µM) a inibição da proliferação celular não ultrapassou os 30%. Apesar da TMZ ser um fármaco que apresenta uma eficácia limitada devido aos mecanismos de resistência, estes resultados demonstram que a utilização conjunta da TMZ com compostos que afetem o equilíbrio redox das células de glioma poderá ser uma estratégia promissora para aumentar o sucesso terapêutico.This work is funded by FCT - Portugal through projects Target_Cancer (PTDC/MEDFAR/31136/2017) and by iMed.ULisboa UID/DTP/04138/2019 both from FCT.Branco, Vasco Rui Veloso NevesCarvalho, Cristina Maria Leitão deRepositório da Universidade de LisboaPires, Vanessa Sofia Amaral2021-12-17T01:30:25Z2019-12-172019-11-222019-12-17T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/43688TID:202382184enginfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2023-11-08T16:44:14Zoai:repositorio.ul.pt:10451/43688Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T21:56:24.974967Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse
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