Desenvolvimento de novas metodologias de purificação de DNA minicircular usando suportes monolíticos

• Autor(a) principal: Diamantino, Tatiana Santos Roque
• Data de Publicação: 2015
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
• Texto Completo: http://hdl.handle.net/10400.6/6073
• topic: Cromatografia de Troca Aniónica; Dna Minicircular; Plasmídeo Parental; Tecnologia de Dna Recombinante; Domínio/Área Científica::Engenharia e Tecnologia::Engenharia Química

Atualmente existem diversas patologias que não têm cura através das terapias convencionais, causando a morte a milhares de pessoas. Assim, torna-se imprescindível o desenvolvimento de terapias alternativas para a sua prevenção e tratamento. A terapia génica e as vacinas de DNA são consideradas terapêuticas promissoras no tratamento de doenças hereditárias e adquiridas. Baseiam-se na transferência de genes e requerem o uso de vetores que sejam seguros e eficientes. Os vetores virais apesar de serem mais eficientes na transferência de genes comprometem a segurança, e como tal tem havido uma crescente aposta na utilização de vetores não-virais como o DNA plasmídico (pDNA). Porém, apesar deste vetor ser mais seguro, de simples produção e de baixo custo, exibe algumas limitações associadas à presença da região de amplificação bacteriana, podendo desencadear respostas inflamatórias e imunitárias ou promover efeitos genotóxicos. Com a finalidade de ultrapassar os obstáculos inerentes ao pDNA, surgiu um novo produto biotecnológico com perspetivas terapêuticas benéficas designado por DNA minicircular (mcDNA). Esta biomolécula resulta de uma recombinação intramolecular do plasmídeo parental (PP) numa cultura bacteriana, sendo constituída exclusivamente pela unidade de transcrição eucariótica. Assim, o mcDNA é considerado um vetor mais seguro, que promove um aumento do efeito terapêutico. Contudo, por ser ainda uma abordagem recente, exige a realização de mais estudos com o objetivo de otimizar-se o processo de recombinação e desenvolver-se um método de purificação adequado, que obedeça às normas impostas pelas autoridades reguladoras, e que consequentemente permita a aplicação terapêutica deste vetor da “nova geração”. O trabalho apresentado nesta tese teve por base o objetivo de obter-se melhores rendimentos de produção de mcDNA, testando diversas percentagens de L-arabinose, e de otimizar a sua recuperação. Posteriormente, foi estudada a etapa de purificação desta biomolécula usando um suporte monolítico de troca aniónica, caracterizado por apresentar uma elevada capacidade de ligação e excelentes propriedades de transferência de massa. Os resultados revelaram que esta coluna apresenta boa resolução e seletividade para separar as impurezas da isoforma superenrolada do mcDNA. Numa primeira fase foi realizada a separação entre o DNA e o RNA, e posteriormente entre o mcDNA e o PP. Averiguou-se que o mcDNA superenrolado tem tendência a eluir primeiramente, o que poder-se-á justificar pelo seu tamanho mais reduzido, apresentando uma densidade de carga inferior. A fim de confirmar-se a pureza da amostra obtida efetuaram-se ensaios de quantificação de diversos contaminantes que revelaram a ausência de RNA e de proteínas, e que a quantidade de DNA genómico e de endotoxinas obedecia aos valores referenciados pelas agências reguladoras, como a “Food and Drug Administration” (FDA). Em suma, a utilização deste suporte monolítico pode ser uma solução promissora para a obtenção da amostra de mcDNA com a qualidade adequada para futuras aplicações terapêuticas.