Caracterização de heteropolissacarídeos por espectrometria de massa

• Autor(a) principal: Gonçalves, Virgínia Maria Ferreira
• Data de Publicação: 2007
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
• Texto Completo: http://hdl.handle.net/10773/2982
• topic: Bioquímica; Espectroscopia de massa; Polissacarídeos

O trabalho de investigação elaborado no âmbito desta dissertação de Mestrado, teve como objectivo a aplicação da Espectrometria de Massa (MS) utilizando métodos de ionização por electrospray (ESI) e ionização por desorção por laser assistida por matriz (MALDI), para a caracterização dos heteropolissacarídeos gelanas e xilanas. Neste trabalho foi efectuada a caracterização de duas gelanas, uma gelana comercial e uma gelana modificada JB3, por ESI MS e espectrometria de massa tandem (MS/MS e MSn). Os heteropolissacarídeos de ambas as gelanas foram submetidos a hidrólise parcial ácida com TFA e, os oligossacarídeos obtidos foram fraccionados por cromatografia de exclusão molecular. Estes oligossacarídeos foram posteriormente identificados por ESIMS e, caracterizados por ESI-MS/MS e MSn. A caracterização estrutural foi obtida por fragmentação dos iões [M+Na]+ identificados nos espectro de ESIMS. Tal análise permitiu identificar em ambas as gelanas, a unidade estrutural típica destes polímeros, a qual é constituída por dois resíduos de Glc, um resíduo de GlcA e um resíduo de Rha, com a sequência GlcGlcAGlcRha. No entanto, verificaram-se também diferenças estruturais entre ambas as gelanas, essencialmente no que diz respeito a grupos substituintes. Assim, verificou-se a presença de grupos glicerato apenas na constituição da gelana modificada, e ausência de grupos acetilo em ambas as gelanas. Xilianas da madeira de Paulowia elongata / Paulownia fortunei foram, no âmbito deste trabalho, isoladas a partir da madeira e caracterizadas por análise de açúcares, H1 RMN e espectrometria de massa (ESI-MS, MS/MS e MALDI-MS). A análise destes resultados revelou que estas xilanas apresentam uma cadeia principal constituida maioritariamente por unidades de (1®4)-b-Dxilopiranose parcialmente acetiladas e ramificada com resíduos de MeGlcA e GlcA. Para a identificação da estrutura primária da xilana, esta foi sujeita a hidrólise parcial ácida e os xilo-oligossacarídeos (XOS) daí resultantes foram posteriormente separados por LEX-SEC. As fracções obtidas foram analisadas por ESI-MS, MS/MS e MALDI-MS. Nos espectros de ESI-MS foram identificadas séries de XOS neutros de pequeno grau de polimerização (DP) e com diferentes graus de acetilação (Xyl2-4Ac0-3), e por MALDI-MS foi possivel identificar XOS neutros, acetilados e não acetilados com maior DP (Xyl6-20Ac0- 9). Neste trabalho foi possível ainda identificar XOS ácidos, através de ESI-MS e MALDI-MS, correspondentes a três séries distintas de XOS, que se podem representar por: Xyl1-11Ac0-7MeGlcA; Xyl5-12Ac0-3MeGlcA2 e Xyl6-20Ac9- 17MeGlcAGlcA. A identificação de XOS neutros com elevado DP, tais como Xyl20Ac10, leva-nos a sugerir que os resíduos ácidos se apresentam distribuidos pela cadeia de xilana, de uma forma irregular. Mais uma vez a espectrometria de massa revelou-se de extrema importância para a identificação e caracterização estrutural de oligossacarídeos. ABSTRACT: The main purpose of the work developed during this study was the application of mass spectrometry (MS) with ionisation methods of elctrospray (ESI) and matrix assisted laser desorption ionisation (MALDI) for the characterisation of the heteropolysaccharides gellans and xylans. In the present work, we compared two different gellans: a commercial gellan and a modified gellan. These heteropolysaccharides were hydrolysed (by acidic hydrolysis) and the oligosaccharides obtained were fractionated by size exclusion chromatography. The fractions obtained were further analysed by MS. The mass spectrometers used in that analysis were ESI-QTOF and ESIlinear ion trap. The structural characterisation was obtained by the analysis of the MS/MS and MSn spectra of [M+Na] + ions identified in the ESI-MS spectra The results showed that both gellans are comprised by a tetrasaccharide repeat unit composed of two molecules of D-glucose (D-Glc), one of Lrhamnose (L-Rha) and one of D-glucuronic acid (D-GlcA),with the following sequence GlcGlcAGlcRha. However some structural differences between the two gellans were detected. The modified gellan showed the presence of glyceryl groups as ramifications, but this is absent in commercial one. Acetyl groups were found to be absent in both gellans. As a part of this work, xylans were isolated from holocellulose of hybrid Paulownia elongate / Paulownia fortunei wood with dimethyl sulfoxide. The composition and the structural features of xylan were elucidated by wet chemistry, NMR (1H NMR, TOCSY, HSQC) and by MS. It was found that Paulownia xylan backbone is constituted of partially acetylated (1®4)-linked b- D-xylopyranosyl units and substituted with GlcA and/or MeGlcA. To identify xylan primary structure, the isolated xylan was also submitted to acid hydrolysis and xylo-oligosaccharides (XOS) obtained were fractionated by LEX-SEC in fractions that comprise neutral or acidic XOS. Structural characterisation of both neutral and acidic XOS were obtained by mass spectrometry with ESI and MALDI (ESI-MS, ESI-MS/MS and MALDI-MS).The neutral XOS identified by ESI-MS correspond to non-substituted XOS with different acetylation degree (Xyl2-4Ac0-3). MALDI-MS allowed the identification of neutral XOS with rather higher DP (Xyl6-20Ac0-9). The acidic fractions, in the ESI-MS and MALDI-MS spectra, revealed the presence of acetylated and non-acetylated acidic XOS, with one and two acidic residues that can be summarized in three different series: Xyl1-11Ac0-7MeGlcA, Xyl5-12Ac0-3MeGlcA2 and Xyl6-20Ac0-17MeGlcAGlcA. The identification by MALDI-MS of large fragments of neutral XOS, such as Xyl20Ac8, suggested that the acidic uronic residues may be irregularly distributed along the xylan backbone.