Optimisation of the fed-batch production of a silk-elastin-like protein: overcoming acetate accumulation and plasmid instability

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Barroca, Mário Jorge Faria
Data de Publicação: 2013
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: eng
Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
Texto Completo: https://hdl.handle.net/1822/27914
Resumo: Dissertação de mestrado em Biofísica e Bionanossistemas
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spelling Optimisation of the fed-batch production of a silk-elastin-like protein: overcoming acetate accumulation and plasmid instability577.112Dissertação de mestrado em Biofísica e BionanossistemasSilk-elastin-like proteins (SELPs) are protein based polymers composed of repetitive amino acid sequence motifs, or variants thereof, found in silk fibroin (GAGAGS) and mammalian elastin (VPGVG). These polymers have a high potential for use in the pharmaceutical, regenerative medicine and materials fields. The successful employment of these polymers in these different areas requires that they can be simply prepared in large quantities on an industrial scale. The present study attempted to increase the production levels of a novel recently described SELP (SELP-59-A) in E. coli. Prior to the present study, the highest reported production level for SELPs was 500 mg/L in E. coli BL21(DE3) with an optimised batch fermentation in shake flasks approach1. It was shown that SELP production was limited with this approach by the accumulation of acetic acid to toxic levels as well as by plasmid loss on induction. In an attempt to overcome these limitations, the use of a fedbatch production approach and of various plasmid stabilisation systems were investigated in the present study. A fed-batch approach was developed and optimised for the successful high cell density production of SELP-59-A. Pre-(0.4 h-1) and post-induction (0.1 h-1) growth rates, dissolved oxygen concentration (15 %), dry cell weight (DCW) on induction (75 g/L) and IPTG concentration for induction (1 mM IPTG) were optimised and allowed for an almost 9-fold increase in SELP-59-A production. This allowed for a reduced cost process with a fedbatch phase of approximately 8 hours. Limiting factors identified were plasmid loss on induction, limitations in the oxygen transfer efficiency of the fermentation instrumentation used and an increased metabolic stress on the host cells following induction. Investigation of ampicillin resistance, kanamycin resistance and a Type II toxin/antitoxin post segregational suicide system (ccdB/ccdA) for reduced plasmid loss indicated the latter to allow for improved plasmid stability and a 50 % increase in SELP-59-A production under the conditions used. Removal or inactivation of the ampicillin resistance marker from the expression vector did not affect production but allows for the production of SELPs for use in biomedical applications. The SELP production levels reported here are the highest to date and represent a 10-fold increase on that previously reported.As proteínas do tipo seda-elastina (SELPs) são uma nova classe de polímeros recombinantes de origem proteica, cuja composição consiste na combinação das sequências repetitivas de aminoácidos comummente encontradas nas proteínas naturais, fibroína (GAGAGS) e elastina (VPGVG). Estes polímeros têm um elevado potencial de aplicação nas áreas de medicina regenerativa, farmacêutica e materiais. Todavia, para que a sua aplicação seja bem sucedida, surge a necessidade de serem facilmente produzidos em larga escala. Como objetivo principal deste estudo, pretendeu-se aumentar os níveis de produção de uma SELP em E. coli. Até à data, o nível de produtividade volumétrica mais elevado descrito para SELPs foi de 500 mg/L, obtido em E. coli, e em condições otimizadas de fermentação em matrazes. Foi demonstrado que a produção de SELP era limitada não só devido à acumulação de ácido acético, conduzindo a níveis tóxicos para a célula, mas também devido à perda de plasmídeo pela indução. No âmbito desta tese e numa tentativa de ultrapassar estas limitações, recorreu-se a uma abordagem de produção em fed-batch, assim como a vários sistemas de estabilização de plasmídeo. Assim, foi desenvolvido e otimizado um processo de fed-batch, o qual demonstrou resultar na produção de SELP-59-A em culturas de elevada densidade celular. Com parâmetros otimizados tais como taxas de crescimento de pré- (0.4 h-1) e pós- indução (0.1h-1), concentração de oxigénio dissolvido (15%) e, indução com IPTG (1 mM IPTG, a um peso seco celular de 75 g/L), permitiu um aumento de quase 9 vezes em relação à produção volumétrica previamente descrita. Isto permitiu obter um processo de custo reduzido com uma fase de fed-batch de cerca de 8 horas. Como fatores limitantes, foram identificados: a perda de plasmídeo na indução, limitações na eficiência da transferência de oxigénio pelo equipamento utilizado e um aumento do stress metabólico nas células hospedeiras após indução. Os estudos de resistência à ampicilina, canamicina e um sistema toxina/antitoxina do tipo II (ccdB/ccdA), foram utilizados para reduzir a perda de plasmídeo, resultando num aumento da estabilidade do plasmídeo e por conseguinte num aumento de 50% na produção de SELP-59-A. Os níveis de produção SELP relatados neste estudo são os mais altos descritos até hoje, representando um aumento de cerca de 10 vezes maior do que descrito na literatura.Collins, TonyCasal, MargaridaUniversidade do MinhoBarroca, Mário Jorge Faria20132013-01-01T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttps://hdl.handle.net/1822/27914eng201434679info:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2023-07-21T12:24:01Zoai:repositorium.sdum.uminho.pt:1822/27914Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T19:17:54.223031Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse
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