Characterization of Chronic Lymphocytic Leukemia by aCGH/MLPA
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| Data de Publicação: | 2018 |
| Tipo de documento: | Dissertação |
| Idioma: | eng |
| Título da fonte: | Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) |
| Texto Completo: | http://hdl.handle.net/10451/35554 |
Resumo: | Tese de mestrado em Biologia Molecular e Genética, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, em 2018 |
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Characterization of Chronic Lymphocytic Leukemia by aCGH/MLPALeucemia Linfocítica CrónicaCNVsiFISHaCGHMLPATeses de mestrado - 2018Domínio/Área Científica::Ciências Naturais::Ciências BiológicasTese de mestrado em Biologia Molecular e Genética, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, em 2018A Leucemia Linfocítica Crónica (LLC) é o tipo de leucemia mais frequente na população adulta de países ocidentais, cuja idade média ao diagnóstico varia entre os 67 e os 72 anos. É caracterizada pela expansão clonal e acumulação de linfócitos B neoplásicos no sangue periférico e na medula óssea, resistentes à apoptose e imunologicamente incompetentes. Estas células têm também a capacidade de infiltrar outros órgãos como o baço ou o fígado. Os indivíduos com LLC apresentam diversas alterações genómicas características, que estão associadas a diferentes subtipos da doença com diferentes comportamentos biológicos e clínicos. Os dois principais subtipos de LLC são caracterizados pela ausência ou presença de genes mutados na região codificante da cadeia pesada da região variável das imunoglobulinas (IGHV), sendo que o estado não mutado destes genes é o que constitui a situação de doença mais agressiva. A sobre-expressão dos genes CD38 e ZAP70 é um parâmetro que auxilia na estratificação de doentes em grupos com diferentes prognósticos que, possivelmente, necessitam de diferentes estratégias terapêuticas. Para além destes marcadores, podem ocorrer alterações epigenéticas; mutações somáticas nos genes MYD88, NOTCH1, SF3B1 e TP53; variações no número de cópias (CNVs) de segmentos de DNA; trissomias 9, 12, 18 e 19, e translocações que envolvam o locus IGH. Uma CNV é um segmento de DNA com pelo menos 1 kilobase (Kb) que apresenta variação no número das suas cópias (perda ou ganho) relativamente a um DNA de referência de um indivíduo saudável. Uma translocação recíproca é uma troca de posições entre dois segmentos de DNA, entre cromossomas não homólogos. Ao longo das últimas décadas estas alterações têm vindo a ser detetadas, na prática clínica, pela técnica de Hibridização Fluorescente In Situ aplicada a células em interfase (iFISH). A iFISH permitiu realizar uma melhor estratificação destes doentes em diferentes grupos, aos quais são associados diferentes prognósticos. Estes grupos baseiam-se na presença de: (i) deleção em 13q como única alteração; (ii) nenhuma alteração; (iii) trissomia 12; (iv) deleção em 11q e (v) deleção em 17p (grupos apresentados por ordem crescente de pior prognóstico previsto), sendo (i) o grupo de melhor prognóstico e (v) o de pior prognóstico. Posteriormente, foram adicionadas a este painel sondas para a deteção da deleção em 6q e translocações do gene IGH. No entanto, devido à heterogeneidade biológica e clínica desta doença, existe consciência da importância de procurar novas CNVs com possível valor como marcadores de prognóstico. De facto, nem todas as terapias desenvolvidas são aplicáveis a doentes com diferentes tipos de alterações. Um exemplo disso é o caso dos doentes com a del(17p) e/ou mutação do gene TP53. Neste grupo de doentes, a quimioimunoterapia é altamente desaconselhada devido ao facto de esta recorrer a agentes dependentes da atividade da proteína p53 que, por estar ausente e/ou mutada nos doentes com del(17p) e/ou mutação do gene TP53, impede que esta terapêutica conduza a resultados favoráveis. Assim sendo, os doentes com estas alterações são candidatos a terapêutica dirigida recorrendo a inibidores da via BTK, como o ibrutinib. Com este trabalho piloto, o nosso grupo realizou a caracterização de uma coorte de 20 doentes com LLC, ao nível do seu conteúdo em CNVs. Para tal, aplicámos as técnicas de Amplificação Multiplex de Sondas Dependente de Ligação (MLPA) e arrays de Hibridização Genómica Comparativa (aCGH), após extração de DNA a partir de células mononucleares do sangue periférico (PBMCs), e tendo em conta o genoma de referência GRCh37/hg9 (Genome Reference Consortium Human Build 37/human genome 19). Após a obtenção de resultados, fizemos um estudo de sobrevivência global ao longo de um período médio de follow-up de 114 meses, aplicando o método estatístico de Kaplan-Meier. Com base nos resultados de MLPA, dividimos as amostras em duas categorias: um grupo com doentes que tinham ≥2 alterações e outro com doentes que tinham <2 alterações. Interpretámos, também, a distribuição de algumas das alterações que detetámos em maior frequência: del(11q), del(14q), e mutação no gene NOTCH1, em doentes agrupados de acordo com o seu estadiamento pelos sistemas Binet e Rai (sistemas de classificação de estadiamento específicos para LLC). Para tal, aplicámos o teste qui-quadrado de Pearson. Relativamente à análise de sobrevivência, apesar de os nossos resultados não terem apresentado significância estatística, estes sugerem que existe uma associação entre o aumento no número de alterações genómicas que um doente tem e a diminuição na taxa de sobrevivência. Quanto às prevalências das alterações del(11q), del(14q) e mutação do gene NOTCH1, verificámos que estas são significativamente mais altas em doentes que se encontram num estadiamento intermédio/alto de risco de doença do que em doentes com estadiamento de baixo risco, o que sugere a sua importância como marcadores de mau prognóstico. Isto é algo que já foi previamente descrito para a del(11q) e para a mutação em NOTCH1 mas, tanto quanto é do nosso conhecimento, é algo que não foi ainda visto, por outros grupos, para doentes com a alteração del(14q). Para além das conclusões tiradas relativamente às alterações genómicas em doentes com esta neoplasia, foi-nos possível fazer algumas comparações entre as técnicas aplicadas. Apresentamos, também, uma comparação crítica entre a aplicação destas tecnologias e a utilização da técnica de diagnóstico iFISH, tanto ao nível da prática clínica como no âmbito da investigação científica. O MLPA e o aCGH demonstraram ser técnicas apropriadas para realizar a caracterização genómica da LLC, uma vez que estas foram capazes de detetar CNVs. A técnica de aCGH permitiu-nos detetar um total de 134 alterações, das quais a maior parte foi vista em regiões que não são estudadas pelo iFISH. Isto provou o seu valor do aCGH como técnica aplicável na investigação de alterações genómicas na LLC. Realizámos, de seguida, a validação dos resultados de aCGH pela técnica de MLPA, o que nos permitiu chegar à conclusão de que todas as alterações detetadas por ambas as técnicas são reais. Concluímos também que o MLPA é uma técnica candidata a substituir a aCGH no âmbito da investigação, principalmente por ser menos dispendiosa e menos morosa. Num contexto de prática clínica, o MLPA poderia eventualmente substituir o iFISH pois também fornece informação sobre a presença das alterações mais comuns: del(11q), trissomia 12, del(13q) e del(17p), bem como sobre a presença de outras alterações características da LLC, mas menos prevalentes: ganho em 2p, del(6q), perda em 8p, ganho em 8q, del(9p21) e trissomia 19. Para além disso, deteta também possíveis mutações somáticas nos genes NOTCH1, MYD88 e SF3B1, que podem ocorrer nesta doença. Contudo, o iFISH é a única destas três técnicas que é capaz de detetar mosaicismos de baixa expressão e a ocorrência de translocações na LLC, tais como: t(14,18)(q32,q24), t(14,18)(q32,q21) e t(14,19)(q32,q13). Estas translocações ocorrem em até 5% dos casos diagnosticados. As nossas perspetivas para trabalhos futuros consistem em aumentar o número de amostras estudadas bem como o tempo de seguimento destas com o objetivo de, numa próxima análise de sobrevivência, alcançar uma maior confiança nos resultados obtidos. Para além disso, temos também o objetivo de reavaliar a importância da del(14q) como possível marcador de mau prognóstico, num grupo maior de doentes. Finalmente, esperamos ser capazes de conhecer melhor a distribuição das alterações que encontrámos com elevada prevalência (del(5q13.2), del(8q24.23), del(22q11.22), del(Xq21.1), dup(4p16.3), dup(6p25.3), dup(8p11.1), and dup(10q11.22)) numa coorte de maior de doentes. Esperamos conseguir identificar, de entre estas alterações, possíveis marcadores de doença, algo que será apenas possível por comparação com uma população controlo. Com o nosso trabalho, esperamos incentivar não só a procura de novos alvos terapêuticos como também a descoberta e avaliação de novas terapias. Por último, propomos a continuação de estudos de caracterização genómica da leucemia linfocítica crónica, destacando o aCGH e MLPA como técnicas preferenciais para esse fim.Chronic lymphocytic leukemia (CLL) is one of the most common hematological malignancies, being the most recurrent type of leukemia in the adult population in western countries. It is characterized by a clonal expansion and accumulation of neoplastic B lymphocytes on peripheral blood and in the bone marrow. There are some characteristic genomic alterations in these individuals, linked to different subtypes of CLL with different biological and clinical behaviors. The two main types of CLL are characterized by either the lack or the presence of mutated genes at the coding region of the immunoglobulins heavy chain’s variable region (IGHV), being the unmutated state the one leading to a more aggressive disease course. Overexpression of the molecular markers CD38 and ZAP70 are also parameters that determine disease stage and help to stratify patients into groups with different prognosis and possible different therapy strategies. Furthermore, there are some CLL characteristic genomic alterations: epigenetic alterations; somatic mutations in MYD88, NOTCH1, SF3B1, and TP53; copy number variations (CNVs) of some DNA regions; trisomies 9, 12, 18, or 19; and some translocations involving the IGH locus. Over the last decades, CLL reported CNVs have been evaluated with the standard technique of interphase Fluorescent In Situ Hybridization (iFISH), in order to stratify patients into different groups of predicted outcomes. Those groups are based on the presence of: (i) 13q deletion as sole alteration; (ii) no alterations; (iii) Trisomy 12; (iv) 11q deletion; and (v) 17p deletion. These groups are presented in order of best (i) to worse disease outcome (v). Subsequently, probes for the detection of 6q deletion and IGH translocations have been added. However, due to the clinical and biological heterogeneity of this disease, it is currently acknowledged that it is important to search for other CNVs that may become new disease markers. Our team has characterized, in this pilot study, a cohort of 20 CLL patients, regarding their CNVs content, in agreement with the Genome Reference Consortium Human Build 37/human genome 19 (GRCh37/hg9). We have applied Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification (MLPA) and array Comparative Genomic Hybridization (aCGH) technologies. We conducted an overall survival analysis of patients presenting either ≥2 alterations or <2 alterations detected by MLPA, based on a median follow-up time of 114 months. Moreover, we have interpreted the distribution of some of the common alterations found: del(11q), del(14q), and NOTCH1 mutation, in patients grouped according to their disease staging by Binet and Rai CLL staging systems. As for the survival analysis, despite the lack of statistical significance, our results show an association between the increasing number of alterations in a patient and a shorter overall survival. Finally, the prevalence of del(11q), del(14q), and NOTCH1 mutation in our samples are significantly higher in patients with intermediate/high risk stages than in low risk disease stage patients, suggesting their value as bad prognosis markers. That is something already known for del(11q) and NOTCH1 mutation but appears to be a new information for patients with del(14q). We conclude that MLPA and aCGH are competent techniques for the genomic characterization of CLL. The aCGH technique has detected additional alterations in regions other than the ones evaluated by the standard diagnosis method iFISH, proving its value as a research tool in CLL. The aCGH results regarding reported CLL CNVs were positively validated by MLPA, showing that MLPA is a good substitute of the aCGH technique on day-to-day research. Moreover, MLPA has the advantages of being a less expensive and less time-consuming technique. In terms of clinical practice, MLPA could substitute iFISH for delivering the same results on del(11q), trisomy 12, del(13q), and del(17p) assessment, and the additional information on the other CNVs it also evaluates (2p gain, del(6q), 8p loss, 8q gain, del(9p21), and trisomy 19), as well as the detection of NOTCH1, MYD88, and SF3B1 somatic mutations. However, iFISH is the only one of these three techniques capable of detecting low expression mosaicism and the presence of translocations, a type of alteration that occurs in up to 5% of patients, making it still irreplaceable. In the future, all our results should be re-evaluated using a larger cohort of patients. Additionally, the survival analysis must be repeated when a larger follow-up time is reached, and the number of samples analyzed is greater. It is also important to re-assess del(14q) value as a possible bad prognosis marker. Additionally, we intend to better characterize the prevalence of del(5q13.2), del(8q24.23), del(22q11.22), del(Xq21.1), dup(4p16.3), dup(6p25.3), dup(8p11.1), and dup(10q11.22) in a larger cohort of CLL patients. Among these alterations, it would be interesting if we could identify possible new markers of diseases something only possible after comparison with a control groups. With our work, we expect to stimulate further research on new therapeutic targets and new treatment strategies. At last, we encourage the continuation of CLL genomic characterization, with the use of both aCGH and MLPA.Carreira, Isabel Maria MarquesGomes, Manuel CarmoRepositório da Universidade de LisboaAdão, Diana Cristina Antunes Candeias2018-11-30T19:02:35Z201820182018-01-01T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/35554TID:202188680enginfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2023-11-08T16:31:41Zoai:repositorio.ul.pt:10451/35554Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T21:50:01.859164Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse |
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