Impact of extracellular vesicles’ cargo in the chemoresistance transfer in glioblastoma

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Barros, Lucas Matheus Padilha
Data de Publicação: 2021
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: eng
Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
Texto Completo: http://hdl.handle.net/10451/56110
Resumo: Tese de Mestrado, Biologia Molecular e Genética, 2021, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências
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spelling Impact of extracellular vesicles’ cargo in the chemoresistance transfer in glioblastomaGlioblastomaQuimiorresistência à TMZVesículas ExtracelularesTeses de mestrado - 2021Domínio/Área Científica::Ciências Naturais::Ciências BiológicasTese de Mestrado, Biologia Molecular e Genética, 2021, Universidade de Lisboa, Faculdade de CiênciasSegundo a Organização Mundial de Saúde (WHO), o glioblastoma (GBM) é uma neoplasia de classe IV com diferenciação astrocística, responsável por aproximadamente 45% de todos os tumores cerebrais primários malignos. Devido à sua natureza altamente invasiva e rápida taxa de proliferação, a ressecção cirúrgica completa do tumor não é exequível. Adicionalmente, a grande heterogeneidade genética típica deste tumor cerebral possibilita um rápido desenvolvimento de resistência à quimioterapia e radioterapia utilizadas, e uma consequente célere recidiva tumoral. Para além da sua grande variabilidade genética intra-paciente, o GBM é também notório pela sua heterogeneidade inter pacientes, o que se revela de forma clara no comportamento patológico diferencial deste tumor, como por exemplo, na resposta aos diferentes tratamentos. Por este motivo, o GBM foi agrupado em diferentes grupos, de acordo com a natureza das suas mutações e com a sua expressão fenotípica. Esta informação pode ser utilizada para personalizar terapias para pacientes com GBM, aumentando assim a sua eficácia. De acordo com o último relatório da WHO de 2016, que clarifica a classificação de tumores do sistema nervoso central através da integração tanto de critérios fenotípicos como genotípicos, o GBM pode ser dividido em dois grupos: Desidrogenase de isocitrato (IDH)-estirpe selvagem e IDH-mutante. Existe ainda um terceiro grupo que inclui todos os diagnósticos de GBM no qual a avaliação do gene IDH é inconclusiva. O perfil genotípico mais comum ocorre em cerca de 90% de todos os casos e está associado a pacientes que apresentam a estirpe selvagem do gene IDH. Esta variante está associada a GBM primários, isto é, tumores com as suas principais mutações a ocorrem de novo, em pacientes com mais de 55 anos, com uma idade mediana de 62 anos aquando do diagnóstico. Este grupo está também associado com uma maior incidência no sexo masculino, com um rácio de 1,42:1 em comparação com o sexo feminino. A taxa de sobrevivência geral de pacientes neste grupo é de apenas 15 meses após diagnóstico. Associado a aproximadamente 10% de todos os casos, a segunda variante mais comum deste tumor está associada com GBM secundários que se desenvolvem em pacientes mais novos, por volta dos 44 anos. Os pacientes neste grupo apresentam mutações no gene IDH, e normalmente possuem um histórico clínico de casos de gliomas difusos de baixo grau. A taxa de sobrevivência nesta variante ronda os 31 meses após o diagnóstico, um pouco mais do dobro quando comparada com a variante IDH estirpe selvagem. Até ao momento, não existe ainda um claro conjunto de sintomas associados com nenhuma variante específica. Os sintomas para ambas as variantes podem incluir défices neurológicos focais progressivos, danos cognitivos e motores, náusea, dor de cabeça e convulsões. Estes sintomas derivam normalmente de fatores como a localização do tumor, destruição direta de tecido cerebral por necrose, ou da pressão intracraniana elevada devido ao volume tumoral. Devido a este conjunto de sintomas ambíguos e a falta de grandes manifestações clínicas, o GBM é normalmente diagnosticado num estádio avançado, revelando assim uma falta de estratégias de diagnóstico eficientes. Os métodos de diagnóstico atualmente utilizados consistem em testes neurológicos, neuroimagem e sobretudo realização de biópsias, apesar do seu caracter invasivo e das limitações deste método em avaliar mudanças na dinâmica tumoral em tempo real. O último grande avanço no tratamento do GBM ocorreu em 2005, quando o pró-fármaco temozolomida (TMZ) foi introduzido em combinação com a radioterapia após ressecção cirúrgica máxima em segurança do tumor. A TMZ é um agente alquilante capaz de causar quebras na molécula de ácido desoxirribonucleico (DNA) através da formação de incompatibilidades no emparelhamento de bases que iniciam ciclos fúteis de reparação de DNA, resultando em morte celular. Este agente é um pró-fármaco que não necessita de ativação metabólica, uma vez que a TMZ é convertida espontaneamente ao seu princípio ativo, o catião eletrofílico altamente reativo metildiazónio. Ao contrário de outros fármacos comumente utilizados em quimioterapia, a TMZ tem a capacidade de atravessar a barreira hematoencefálica e atingir a localização tumoral em concentrações adequadas. Esta capacidade deve-se não só ao facto de que este pró-fármaco possui uma massa molecular de apenas 194 Da, mas principalmente devido ao seu padrão de degradação a diferentes valores de pH. O efeito citotóxico e citostático mediado por TMZ é geralmente causado pela metilação de uma guanina na posição O6, resultando no seu mal emparelhamento com uma timina durante a replicação que despoleta os vários ciclos fúteis de reparação de DNA mencionados anteriormente. No entanto, este aduto pode ser reparado pela enzima O6-metilguanina-DNA metiltransferase (MGMT). Metade dos pacientes diagnosticados com GBM possuem o promotor da enzima MGMT metilado, resultando numa menor expressão da mesma e num maior efeito citotóxico e citostático. Todavia, a outra metade dos pacientes é geralmente intrinsecamente resistente a TMZ devido a não possuírem a expressão de MGMT silenciada. Adicionalmente, após realização de quimioterapia com TMZ, existe uma pressão seletiva sobre as células para a perda do silenciamento do promotor do gene MGMT, resultando assim em quimiorresistência a TMZ. Uma vez que existe uma escassez de fármacos aprovados para o tratamento de primeira linha do GBM, é importante aprofundar o conhecimento das vias biológicas que levam ao desenvolvimento de resistência à TMZ, com o objetivo de potencialmente melhorar a eficácia do medicamento e retardar o desenvolvimento de quimiorresistência. As vesículas extracelulares (EVs) são um grupo heterogéneo de nanoestruturas de bicamada lipídica, que atuam como transportadoras biológicas de macromoléculas, como lipídios, proteínas e ácidos nucleicos. A biogénese destas estruturas é altamente dependente do tipo de célula, do seu estado fisiológico ou patológico e dos estímulos do microambiente celular. Devido às suas funções na comunicação celular, as EVs estão implicadas em vários processos fisiológicos e patológicos, incluindo funções importantes na biologia tumoral. Exemplos destas são: a promoção da proliferação e invasão celular, auxílio no aparecimento de metástases e angiogénese, e desenvolvimento de resistência às terapias utilizadas. Por este motivo, o estudo de EVs no contexto da biologia tumoral tem recebido grande atenção. Isto deve-se ao facto destas vesículas terem a potencialidade de servirem como biomarcadores do estado patológico das células cancerígenas em tempo real, mas também devido ao seu potencial valor terapêutico. O objetivo principal do presente estudo foi compreender melhor o impacto das EVs na transferência de quimiorresistência à TMZ entre linhas celulares com diferentes níveis de resistência. Deste modo, foram isoladas EVs através de um método baseado na ultracentrifugação diferencial em gradiente de densidade, sendo posteriormente validadas biologicamente. Estas vesículas foram isoladas de uma linha celular resistente a este pro-fármaco, T98G, e de uma linha celular sensível, U-251. De modo a serem identificadas possíveis diferenças na carga de vesículas extracelulares de células tratadas com TMZ, estas também foram isoladas de células cultivadas na presença deste pró-fármaco. Com a finalidade de estabelecer a concentração de TMZ utilizada nestas experiências, foram realizados dois ensaios, um referente à viabilidade celular com MTT e outro para avaliar a proliferação utilizando sistemas de análise Incucyte®. Para este trabalho, foi estipulado que a concentração de TMZ utilizada sobre as células T98G e U-251 seria 300 µM e 50 µM, respetivamente. Utilizando sistemas de análise Incucyte®, ao avaliar a proliferação de células U-251 tratadas com TMZ juntamente com EVs previamente isoladas, foi possível observar uma maior proliferação celular nestas condições quando comparadas às células que foram tratadas apenas com TMZ. Apesar da falta de significado biológico deste resultado, vários estudos publicados no decorrer desta dissertação corroboraram que as EVs têm a capacidade de transferir quimiorresistência entre células com diferentes graus de sensibilidade à TMZ. Por exemplo, foi demonstrado que EVs com níveis elevados de ácido ribonucleico longo não codificante (lncRNA) SBF2-AS1 derivadas de células com resistência a TMZ, foram capazes de transmitir quimiorresistência a células sensíveis em GBM. Outro estudo do mesmo laboratório, demonstrou que EVs derivadas de células de GBM resistentes a TMZ contendo níveis elevados de microRNA 1238 (miR-1238) foram também capazes de conferir resistência em células sensíveis. Embora se tenha tornado evidente que as vesículas extracelulares estão implicadas em vários processos biológicos, incluindo quimiorresistência no GBM, a tradução deste conhecimento em aplicações clínicas exigirá uma compreensão mais profunda das EVs. Além do já mencionado valor intrínseco das vesículas extracelulares como biomarcadores do estado patológico, há uma grande janela de oportunidade no uso destas mesmas vesículas como alvos ou vetores terapêuticos num futuro próximo.Glioblastoma (GBM) is a class IV neoplasm with astrocytic differentiation, which accounts for approximately 45% of all primary malignant brain tumours. Due to its highly invasive nature and rapid proliferation rates, complete tumour resection is not viable, while its great genetic heterogeneity enables a fast tumour recurrence and chemoresistance emergence. The last major advance in GBM treatment occurred in 2005, when temozolomide (TMZ) was introduced in combination to radiotherapy after maximal safe tumour resection. Opposed to many chemotherapeutic drugs, TMZ has the capacity to cross the blood-brain barrier and reach intracranial tumour sites in appropriate concentrations. TMZ is an alkylating agent which causes deoxyribonucleic acid (DNA) strand breaks through the formation of base mismatches that initiate futile DNA repair cycles, thus leading to cell death. However, the majority of the patients are either intrinsically chemoresistant or acquire resistance shortly after chemotherapy. Since there is a limited number of drugs available for GBM treatment, there is a need to better understand the biological pathways that leads to TMZ chemoresistance in order to potentially improve drug efficacy. Extracellular vesicles (EVs) are a heterogeneous group of lipid bilayer nanostructures, which acts as biological carriers of macromolecules, such as lipids, proteins and nucleic acids. The biogenesis of these structures is highly dependent on cell-type, microenvironmental stimuli and physiological status of the cells. Due to their role in the interplay between cells, EVs are implicated in several physiological and pathological processes, including important roles in tumour biology. The main goal of the present study was to further understand the impact of extracellular vesicles in the transfer of temozolomide chemoresistance between cell lines with different resistance levels. With the aim of extending the knowledge on the EVs impact on chemoresistance transfer of TMZ in GBM, these vesicles were isolated from a TMZ resistant GBM cell line, T98G, and from a sensitive cell line, U-251. In order to identify possible differences in the cargo of extracellular vesicles from cells treated with temozolomide, these vesicles were also isolated from cells which were cultured in the presence of TMZ. By assessing the cell proliferation of U-251 cells treated with TMZ and isolated EVs, it was possible to observe a less extensive impairment on the cell proliferation when compared to cells that were solely treated with temozolomide. Despite the lack of biological significance of these results, several studies published in the course of this dissertation corroborated that EVs have the capacity to transfer resistance between cells with different degree of TMZ sensitiveness. Although it has become evident that EVs are implicated in several biological processes, including chemoresistance in GBM, the translation of this knowledge into clinical applications will require a deeper understanding of the extracellular vesicles. Besides the intrinsic value of EVs as biomarkers of GBM status, there is a great window of opportunity in using these vesicles as targets or therapeutic delivery vehicles in the near future.Bjerkvig, RolfCaeiro, Maria FilomenaRepositório da Universidade de LisboaBarros, Lucas Matheus Padilha2023-02-01T17:12:42Z202120212021-01-01T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/56110TID:202933270enginfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2023-11-08T17:03:30Zoai:repositorio.ul.pt:10451/56110Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T22:06:39.730055Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse
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