Screening of antibiotic resistance determinants in Gram-negative bacteria isolated from environmental reservoirs

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Carvalho, Sofia Rêgo de, 1988-
Data de Publicação: 2011
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: eng
Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
Texto Completo: http://hdl.handle.net/10451/6586
Resumo: Tese de mestrado. Biologia (Microbiologia Aplicada). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2011
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spelling Screening of antibiotic resistance determinants in Gram-negative bacteria isolated from environmental reservoirsMicrobiologiaBactérias gram-negativasResistência aos antibióticosQuinolonasProteínasTeses de mestrado - 2011Tese de mestrado. Biologia (Microbiologia Aplicada). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2011Antibiotics are one of the most successful forms of chemotherapy and saved million of lives placing most bacterial infectious diseases under control. However, this success has been compromised the continuous selective pressure exerted by antibiotics use has resulted in multi-resistance bacteria bearing resistance mechanisms to several antibiotics. Nowadays, there is an increased recognition that not only clinical settings constitute resistance reservoirs. The soil is a vast reservoir of resistance mechanisms and their associated genes, so understanding the resistant determinants present in the soil, the soil resistome, will provide information about antibiotic resistance frequencies and also emergence of new resistance mechanisms. Quinolones are an important group of synthetic antibiotics, recently plasmid mediated quinolone resistance mechanisms were established, some originated in environmental reservoirs. In this work the main goal was to study a collection of (fluoro)quinolone resistant environmental isolates, in terms of their ciprofloxacin MIC and screen them for the presence of qnr genes. With a smaller group of isolates the phenotypic impact of ciprofloxacin in growth curves/cellular viability was studied and finally detected and characterized induced variations of cell protein profiles, to study how ciprofloxacin affects, at a molecular level these bacteria. Results showed that ciprofloxacin MIC values had similar distributions in the soil samples from the two sample types from where these strains were isolated; in terms of resistance determinants results point that a qnrS gene was found in a Comamonas testosteroni isolate. In the second part of this work, Stenotrophomonas maltophilia response to ciprofloxacin was studied, and the growth curves/cellular viabilities results showed that S. maltophilia cells tolerate/resist ciprofloxacin action when in stationary growth. Significant differences were observed between cell total protein profiles from cells exposed to ciprofloxacin and the control. That study can help understand bacterial general response to fluoroquinolones, in addition to more classical genetic mutation, and also what intracellular pathways this antibiotic might trigger.A utilização de antibióticos permitiu salvar milhões de vidas e controlar inúmeras doenças infecciosas, contudo a eficácia destes fármacos está hoje em risco. A utilização generalizada dos antibióticos levou ao aparecimento e disseminação de diversos mecanismos de resistência aos antibióticos que comprometem a eficácia dos mesmos. As bactérias multi-resistentes estão a tornar-se um grave problema de saúde pública, pois possuem mecanismos de resistência para várias classes de antibióticos, restando assim poucos antibióticos eficazes para a sua terapêutica. Durante as últimas décadas, o estudo da resistência aos antibióticos focou-se sobretudo nos meios clínicos e em microrganismos patogénicos. Mas, recentemente, tem sido reconhecido que outros ambientes e microrganismos não patogénicos também contribuem largamente para o processo de desenvolvimento e disseminação de mecanismos de resistência. Um dos ambientes cuja importância em termos de reservatório de resistência tem sido reconhecida é o solo. É um ecossistema complexo onde os antibióticos e os seus genes de resistência sempre estiveram presentes devido aos microrganismos produtores de antibióticos. Contudo, diversas actividades antropogénicas provocam a contaminação do solo com antibióticos e microrganismos resistentes o que influencia não só a estrutura da microbiota do solo como contribui para o desenvolvimento de mecanismos de resistência aos antibióticos. Num estudo recente, em que se analisou o nível de resistência de bactérias do solo a diversas classes de antibióticos, verificou-se que a maioria delas é multi-resistente e são resistentes mesmo a antibióticos sintéticos como as quinolonas. Este e outros estudos contribuíram para o reconhecimento da importância do solo como um reservatório para a emergência de mecanismos de resistência e bactérias resistentes. Surgiu assim um novo conceito, o resistoma do solo que consiste no conjunto de determinantes de resistência presentes no solo. As quinolonas são um grupo de antibióticos sintéticos que inibe a replicação e transcrição do DNA bacteriano conduzindo à morte celular. Durante muitos anos, pensou-se que a resistência às quinolonas se devia apenas a mutações que modificassem as enzimas alvo (topoisomerases tipo II) ou activassem a expressão de bombas de efluxo. Contudo, nos últimos anos novos mecanismos de resistências às quinolonas codificados em plasmídeos têm sido identificados. Um desses mecanismos é o gene qnr, codifica uma proteína que protege o DNA e as topisomerases tipo II do efeito das quinolonas. Recentemente a proteómica tem sido utilizada como uma nova abordagem no estudo da resposta bacteriana a diversos estímulos do meio, entre os quais podemos considerar a exposição aos antibióticos. O proteoma é o conjunto de proteínas produzidas por uma bactéria num determinado momento; ao contrário do genoma, o proteoma é dinâmico e varia rapidamente em função dos diferentes estímulos do ambiente onde as bactérias se encontram. A comparação entre perfis proteicos de bactérias não expostas e expostas a antibióticos está a ser utilizada no estudo dos mecanismos de resistência e resposta das bactérias aos antibióticos ou no modo de acção dos mesmos. O objectivo geral deste trabalho foi estudar uma colecção de bactérias ambientais resistentes às (fluoro)quinolonas, isoladas de solos provenientes de dois tipos de locais, quintas de produção animal e margens do rio Tejo, onde diversos factores podem contribuir para o desenvolvimento de resistências. Primeiro, esta colecção de isolados foi caracterizada em termos da sua resistência à ciprofloxacina e foi feita uma triagem do gene qnr. Para a execução do segundo objectivo deste trabalho realizaram-se curvas de crescimento e viabilidades para estudar de que forma a ciprofloxacina afecta o crescimento de Stenotrophomonas maltophilia. Perfis protéicos totais de culturas de S. maltophilia crescidas sem ou com ciprofloxacina foram comparados para determinar variações que possam reflectir as mudanças fisiológicas desencadeadas por este antibiótico. O nível de resistência dos isolados foi estabelecido pela determinação da sua CMI (concentração mínima inibitória) para a ciprofloxacina. Comparando os valores de CMI obtidos entre os isolados provenientes dos dois tipos de locais de amostragem, margens do rio Tejo e quintas de produção de animais, verificamos que são semelhantes, sendo que a maioria das CMI é entre 1 e 8 μg/ml. Para pesquisar a presença de isolados qnr-positivos nesta colecção de bactérias ambientais efectuamos um PCR multiplex com três conjuntos de primers previamente descritos, desenhados para amplificar as principais famílias do gene qnr estudadas até agora: qnrA, qnrB e qnrS. Dos 112 isolados só para um, mais tarde identificado como Comamonas testosteroni, se obteve amplificação positiva. Contudo estes resultados apresentam alguma reserva pois a amplificação não foi totalmente específica e só estudos adicionais permitirão confirmar se este se trata ou não do primeiro gene qnr encontrado em C. testosteroni. Para a realização do segundo objectivo principal deste trabalho o grupo de estirpes em estudo foi reduzido. Primeiro, os isolados com maior CMI para a ciprofloxacina foram identificados por galerias API®. Estes 16 isolados pertencem a 4 géneros diferentes, Comamonas, Acinetobacter, Stenotrophomonas e Aeromonas. Seguidamente para os isolados seleccionados foram determinadas as CMI e os halos de inibição para alguns antibióticos da classe dos β-lactâmicos. Os resultados revelaram que os isolados S. maltophilia são os que apresentam maior nível de resistência a esta classe de antibióticos. Com base em todos os resultados obtidos previamente optou-se por utilizar os oito isolados de S. maltophilia para a realização do segundo objectivo principal deste trabalho. Primeiro foram realizadas curvas de crescimento em que diferentes quantidades de ciprofloxacina, correspondentes a 1/2MIC, MIC e 2xMIC de cada isolado, eram adicionadas a culturas de S. maltophilia durante a fase exponencial de crescimento ou durante a fase estacionária de crescimento. Em paralelo, diluições da cultura foram plaqueadas para testar como a ciprofloxacina estava a afectar a viabilidade celular. Em conjunto estes resultados permitiram verificar que as curvas de crescimento por OD não reflectem o efeito que a ciprofloxacina está a ter nas células S. maltophilia. Quando a ciprofloxacina é adicionada, durante a fase exponencial, a viabilidade celular decresce significativamente comparativamente ao controlo mas tal descida não se reflecte numa descida de OD600nm nas curvas de crescimento. A análise dos resultados obtidos quando a ciprofloxacina é adicionada a bactérias que já se encontram em fase estacionária indica que nesta fase estas toleram e/ou resistem à presença de ciprofloxacina pois o tratamento com este antibiótico não provoca morte celular. Perfis proteicos de culturas de S. maltophilia crescidas em diferentes condições foram obtidos por SDS-PAGE. Primeiro num sistema de mini géis com o qual os géis obtidos não permitiram uma suficiente discriminação do padrão mas revelaram uma clara distinção entre os perfis de células em fase exponencial ou estacionária. Visto as células de S.maltophilia serem afectadas pela ciprofloxacina, quando em crescimento exponencial, os perfis proteicos das células nestas condições foram repetidos em géis de maiores dimensões. Deste modo, foi possível obter perfis proteicos com maior resolução e comparar os perfis proteicos das células em condições controlo com as expostas à ciprofloxacina. Esta comparação revelou diferenças significativas, especialmente para o caso do isolado S. maltophilia 4 indicando que os perfis proteicos reflectem o ambiente de crescimento das bactérias e nomeadamente o stress induzido pela ciprofloxacina. O estudo mais pormenorizado destas variações do proteoma, recorrendo a técnicas como géis 2D e espectofotometria de massa, está em curso e permitirá identificar proteínas com potencial relevância nos processos de resistência ou no modo de acção da ciprofloxacina.Freire, PatrickChambel, Lélia Mariana Marcão, 1964-Repositório da Universidade de LisboaCarvalho, Sofia Rêgo de, 1988-2012-06-26T16:49:12Z20112011-01-01T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/6586enginfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2023-11-08T15:49:09Zoai:repositorio.ul.pt:10451/6586Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T21:31:39.463743Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse
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