Functional analysis of candidate genes affecting Hoxa10 activity
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| Data de Publicação: | 2017 |
| Tipo de documento: | Dissertação |
| Idioma: | eng |
| Título da fonte: | Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) |
| Texto Completo: | http://hdl.handle.net/10451/30314 |
Resumo: | Tese de mestrado, Biologia Evolutiva e do Desenvolvimento, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2017 |
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Functional analysis of candidate genes affecting Hoxa10 activityHox genesGrg3Smad4IFT144Motivo C1Teses de mestrado - 2017Departamento de Biologia AnimalTese de mestrado, Biologia Evolutiva e do Desenvolvimento, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2017Hox genes encode transcription factors that control axial patterning in all bilaterians. They are characterized by the presence of a protein motif, the homeodomain (HD), which is responsible for the physical interaction between Hox proteins and their DNA targets. In vertebrates, Hox10 genes have rib-repressing activity, which determines the thoracic to lumbar transition, a functional property not shared by any other Hox protein. Previous work showed that Hox10 functional specificity does not reside in their HD but requires input from other parts of the protein. This includes a conserved motif, known as C1. A yeast two-hybrid screen identified several factors potentially interacting with C1, which could be candidates for Hox10 functional cofactors. Here, we analysed some of those factors, including Grg3, IFT144 and Smad4 for their ability to interact with Hoxa10 in a co-immunoprecipitation assay in cultured cells. These experiments failed to detect interactions between any of these proteins and Hoxa10, thus arguing against them being Hox10 cofactors. In addition, we created a new mutant line for Grg3 and analysed its role in skeletal formation. These analyses revealed that the axial skeleton in general and ribs in particular form in the absence of Grg3, thus reinforcing the conclusion that this protein is not a functional cofactor of Hox10 proteins. In addition to this, we further tested the role of the C1 motif for the rib-repressing function of Hox10 proteins by testing several deletion mutants in transgenic mouse embryos. These experiments indicated that C1 plays a role in Hox10 rib-blocking function. In addition, when the C1 motif was introduced into Hoxb9, the chimeric protein blocked rib formation in transgenic embryos, a property absent from the native Hoxb9 protein. These experiments showed that the C1 motif is also sufficient to promote a rib-repressing function. Surprisingly, these embryos also contained skeletal phenotypes consistent with abnormal segmentation of the paraxial mesoderm. These data suggest that the C1 motif might interact with the segmentation clock opening the possibility that regulation of rib formation might occur by modulating specific features of the segmentation network.Os genes Hox codificam factores de transcrição que controlam a padronização axial em todos os Bilatéria. São caracterizados pela presença de um motivo proteico, o homeodomínio (HD), responsável pela interacção física entre proteínas Hox e os seus alvos. Em vertebrados, existem 39 genes Hox distribuídos por treze grupos parálogos e organizados em quatro grupos (A, B, C e D). Uma vez que o motivo HD é necessário para a função das proteínas Hox, seria de esperar que também fosse responsável pelas diferentes funções de cada grupo parálogo. No entanto, este não é o caso dado que HDs de diferentes grupos ligam sequências muito semelhantes. De facto, foi relatado que a especificidade funcional está relacionada com regiões fora do HD. Um bom exemplo disso é a proteína Hoxa10, parte do grupo Hox10. Composto por três proteínas, este grupo foi associado ao desenvolvimento correto da região lombar. Sobreexpressar apenas um membro do grupo (Hoxa10) na mesoderme pré-somítica é suficiente para originar embriões de ratinho (M. musculus) sem costelas. A inactivação dos três membros produz o resultado oposto, com costelas ao longo da região torácica e lombar. Portanto, este grupo não tem apenas uma actividade de repressão de formação das costelas, mas é também essencial na transição torácica para lombar. Também acontece que as três proteínas Hox10 partilham um motivo idêntico entre elas chamado M1. Este motivo de sete aminoácidos está adjacente ao HD e quando foram utilizadas construções com este motivo ausente, a proteína Hoxa10 praticamente perdeu a sua função repressora. Para complementar, o M1 foi inserido no Hoxb9. Neste caso, os embriões resultantes não exibiram fenótipos anormais ao nível das costelas. Em conjunto, estes resultados indicam claramente que o motivo M1 é necessário, mas não é suficiente para conferir uma função repressora ao Hoxa10. Trabalho do laboratório Mallo também identificou um outro motivo que se pensa que interage com outras proteínas, o C1. Apesar de não ser tão conservado entre os elementos do grupo proteico Hox10, um sistema de duplo híbrido em leveduras identificou várias proteínas a interagir com o C1, podendo essas ser cofactores funcionais do grupo Hox10. Várias destas proteínas continham domínios WD40, uma propriedade estrutural que serve como “molde” para interacções entre proteínas ou entre ADN e proteínas. Também foram identificadas outras proteínas sem estes domínios. Este trabalho teve dois grandes objectivos: 1) analisar três candidatos a cofactores funcionais de Hoxa10 e 2) compreender a importância do motivo C1 na especificidade funcional do grupo Hox10. A primeira proteína candidata estudada foi a Grg3. Esta foi uma das proteínas detectadas que continham domínios WD40. É uma co-repressora da transcrição e foi reportada a expressão da sua homóloga humana, TLE3, no esclerótomo, o precursor das vértebras e costelas. Foram usadas duas abordagens para testar se a Grg3 poderia estar a interagir com o Hoxa10. Primeiro, células humanas (293T) foram transfectadas com os domínios WD40 da Grg3 e também com Hoxa10. Os extractos celulares foram posteriormente usados numa co-imunoprecipitação (Co-IP). Estas experiências não foram capazes de detectar Grg3 no imunoprecipitado. Além disto, utilizando técnicas de imunocitoquímica, confirmámos que a Grg3 estava localizada no núcleo. Em conjunto, estes dados indicam que Hoxa10 e Grg3 não interagem uns com os outros. A segunda abordagem consistiu em eliminar a expressão de Grg3 usando o sistema CRISPR/Cas9. Os embriões homozigotos E18.5 não revelaram qualquer tipo de alterações no fenótipo das costelas e a expressão de Myf5, um marcador muscular induzido por Hoxa10, manteve-se inalterada em embriões E10,5. Logo, estes resultados reforçam a ideia que a Grg3 não interage com Hoxa10. A IFT144 também foi transfectada em conjunto com Hoxa10. Esta proteína de transporte intraflagelar contém vários domínios WD40 e foi reportado que sua inactivação resulta em defeitos no desenvolvimento das costelas e no início da somitogénese. Ainda que não tenha sido detectada no sistema de duplo híbrido tendo em conta suas características estruturais e funcionais também foi testada. Primeiro, a expressão de IFT144 foi estudada e, apesar de ser expressa de forma ubíqua, está localizada na mesoderme pré-somítica. Em segundo lugar, a localização da proteína foi confirmada no núcleo, bem como no citoplasma. Em terceiro lugar, a técnica da Co-IP foi novamente usada e revelou que a IFT144 não parece estar a interagir com Hoxa10. Smad4, outro possível cofactor do Hoxa10, faz parte da via de sinalização TGF-β e é conhecido por fazer parte de complexos que actuam como factores de transcrição. Embora não contenha nenhum domínio WD40, foi uma das proteínas detectadas no sistema de duplo híbrido e também está associada à padronização do eixo antero-posterior. Neste caso foi usada apenas a abordagem da transfecção seguida pela Co-IP. Mais uma vez, não foi detectada qualquer tipo de interação entre as duas proteínas. Como já foi mencionado anteriormente, o segundo objectivo deste trabalho passava por compreender a importância do motivo C1 na especificidade funcional do grupo Hox10. Para tal, foram utilizadas diferentes construções transgénicas, que continham diferentes versões da proteína Hoxa10. A maior parte dos ratinhos transgénicos que sobreexpressavam uma versão do Hoxa10 que não possuía o motivo C1 (DllHoxa10ΔC1) não desenvolveram costelas. Alguns destes transgénicos tinham fenótipos menos severos (faltavam algumas costelas), algo que nunca foi reportado em trabalhos onde foi feita a sobreexpressão de Hoxa10. Logo, pode-se concluir que a função de repressão do Hoxa10 foi parcialmente perdida, sugerindo que C1 tem um papel na mesma. Esta ideia foi reforçada por outras duas construções que não possuíam diferentes partes do motivo C1. DllHoxa10ΔC1p2 deu origem a embriões E18.5 com fenótipos pouco severos, enquanto DllHoxa10ΔC1p1 apresentava um embrião sem costelas. O resultado mais interessante veio da construção transgénica DllHoxb9insC1 quando o motivo C1 foi colocado na proteína Hoxb9, uma proteína que normalmente não tem efeito na formação de costelas. Neste caso foram observados vários embriões sem costelas. Pode-se assim concluir que o C1 não é apenas necessário, mas é também suficiente para conferir uma função repressora da formação de costelas. Mais surpreendente, foi o facto de alguns destes embriões exibirem graves defeitos na segmentação. Esta ideia foi corroborada pelas hibridações in situ em embriões E11.5, que practicamente perderam a expressão de Tbx18 e Uncx4.1 e com Paraxis a evidenciar uma segmentação anormal da mesoderme paraxial. Estes dados sugerem que o motivo C1 poderá interagir com o relógio de segmentação, abrindo a possibilidade que a regulação da formação de costelas pode ocorrer através da modulação de características específicas da rede de segmentação.Perez, Moises MalloThorsteinsdóttir, Sólveig, 1962-Repositório da Universidade de LisboaMesquita, André Daniel Faustino2018-01-08T16:44:37Z201720172017-01-01T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/30314TID:201872412enginfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2023-11-08T16:23:07Zoai:repositorio.ul.pt:10451/30314Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T21:46:05.682585Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse |
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