Characterization of Haemophilus influenzae isolates from healthy children attending day-care centers in the Lisbon region in 2018-2019

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Cavaco, Luís Filipe Paulino
Data de Publicação: 2020
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: eng
Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
Texto Completo: http://hdl.handle.net/10451/47737
Resumo: Tese de mestrado em Microbiologia Aplicada, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2020
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spelling Characterization of Haemophilus influenzae isolates from healthy children attending day-care centers in the Lisbon region in 2018-2019Haemophilus influenzaeHaemophilus influenzae não tipávelColonizaçãoGenes de virulênciaSequenciação de Alto DébitoTeses de mestrado - 2020Domínio/Área Científica::Ciências Naturais::Ciências BiológicasTese de mestrado em Microbiologia Aplicada, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2020Haemophilus influenzae é uma bactéria Gram-negativa polimórfica. O único hospedeiro conhecido para esta bactéria é o Homem. A interação entre bactéria e hospedeiro acontece através da colonização assintomática da mucosa do trato respiratório, podendo esta interação envolver formação de biofilme. H. influenzae está associado a infeções que podem ir desde infeções ligeiras do trato respiratório até infeções graves, como é o caso da meningite e septicémia. As estirpes de H. influenzae podem ou não expressar uma cápsula polissacarídica, sendo designadas, respetivamente, por capsuladas ou não capsuladas, sendo estas últimas também conhecidas por não tipáveis (NTHi). As estirpes capsuladas podem ser divididas em seis serotipos diferentes (a-f) de acordo com o polissacárido que expressam, sendo este o principal fator de virulência em H. influenzae. O locus onde se encontram os genes responsáveis pela produção da cápsula encontra-se dividido em três regiões distintas. A região I é formada por 4 genes bex que são responsáveis por codificar o transportador do polissacárido, enquanto que a região II é responsável pela produção do polissacárido (específico para cada um dos serótipos). Por último, a região III, formada por 2 genes hcs, codifica proteínas que são responsáveis pelo transporte do polissacárido para o exterior. As regiões I e III são comuns a todos os isolados capsulados, enquanto que a região II varia consoante o serótipo. As estirpes NT, como o nome indica, não possuem o locus da cápsula. Hib é considerado o serótipo mais virulento e foi, até à introdução da vacina, o principal serótipo em circulação e o serótipo associado aos casos mais graves de doença, como meningites, septicémias e pneumonias. Após a produção da vacina contra o Hib e a vacinação massiva da população, verificou-se uma mudança na epidemiologia de H. influenzae: NTHi tornou-se o principal tipo de H. influenzae em circulação e, apesar de ser menos virulento que as estirpes capsuladas, o número de casos de infeção aumentou; para além disso, ao longo das duas últimas décadas, tem-se verificado um ligeiro aumento dos serótipos não b em casos de doença. Este trabalho teve como objetivo contribuir para o estudo da epidemiologia de H. influenzae em Portugal. Especificamente, pretendeu-se comparar estirpes de colonização isoladas da nasofaringe de crianças saudáveis com estirpes clínicas, de forma a avaliar a relação entre ambas. Nos últimos anos surgiram, em crianças portuguesas, alguns casos de infeções causadas por Hib que foram associados a falências vacinais. Assim, pretendemos, também, avaliar se o Hib está em circulação entre as crianças mais novas. Para tal, partimos de uma amostragem de 891 exsudados da nasofaringe de crianças saudáveis, com idades inferiores a 6 anos, a frequentar infantários da região de Lisboa nos anos de 2018 e de 2019. Através de métodos fenotípicos, que incluíram o isolamento em meios de cultura seletivos e a observação da morfologia das colónias, isolámos 764 estirpes que identificámos, presumivelmente, como H. influenzae. Através de PCR convencional determinámos quais as amostras que possuíam cápsula (pela amplificação do gene bexA). A caracterização do serotipo das estirpes capsuladas foi determinada por um PCR específico para cada tipo capsular. Dos 764 isolados, 745 eram NTHi, quatro Hia, um Hib, sete Hie e sete Hif. Nenhuma das estirpes foi caracterizada com o serótipo c ou d. Analisámos a produção de β-lactamases em todos os isolados, através de uma reação colorimétrica com nitrocefim, e determinámos a concentração inibitória mínima (CIM) para vários agentes antimicrobianos de classes diferentes, nos isolados capsulados e nos isolados produtores de β lactamases. Os resultados obtidos mostraram que 6.3% das estirpes são produtoras de β lactamases. A determinação da CIM indicou que a maioria dos isolados são suscetíveis aos agentes antimicrobianos testados. Uma das estirpes produtoras de β-lactamases apresentou resistência a três antimicrobianos de três classes diferentes, pelo que foi considerada multirresistente. De forma a complementar o nosso estudo e de forma a comparar mais detalhadamente as estirpes de colonização com as estirpes clínicas, sequenciámos o genoma total das 19 estirpes capsuladas e de duas outras estirpes com potencial interesse epidemiológico: uma estirpe NTHi produtora de β-lactamase e resistente a amoxicilina/ácido clavulânico (BLPACR), e uma estirpe de Haemophilus parainfluenzae que, numa fase preliminar, tinha sido identificada como H. influenzae capsulado. Utilizando o esquema de MLST descrito para H. influenzae, determinámos os STs de todos as estirpes sequenciadas (exceto para a estirpe de H. parainfluenzae). Detetámos 7 STs (ST6, ST18, ST23, ST122, ST124, ST145 e ST973), sendo que as amostras com o mesmo ST foram consideradas como sendo do mesmo clone e as amostras que apresentavam uma única variação no perfil alélico foram consideradas relacionadas. Procedemos à análise da presença e ausência de 105 genes de virulência escolhidos a partir de uma revisão bibliográfica. Os resultados obtidos revelaram que a presença e ausência dos genes de virulência poderá estar relacionada com o serotipo capsular, pois não foram detetadas muitas variações dentro de cada serotipo (apenas uma num isolado do serotipo e). O serotipo b foi o que apresentou mais genes de virulência (n=91), algo que já era esperado tendo em conta que é considerado o serotipo mais virulento de H. influenzae. Investigámos a presença de genes que conferem resistência aos antimicrobianos estudados e detetámos genes que codificam β-lactamases em três das estirpes capsuladas, o que já era esperado tendo em conta o resultado positivo observado com o teste colorimétrico com nitrocefim. Para a estirpe identificada como BLPACR, detetámos alterações nos aminoácidos que compõem a proteína de ligação à penicilina do tipo 3 (PBP3), o que justifica o seu fenótipo de resistência à amoxicilina/ácido clavulânico. Por fim, construímos uma árvore filogenética com base no genoma core das estirpes de H. influenzae que sequenciámos e no genoma core de algumas estirpes clínicas capsuladas que se encontram descritas na literatura. Ao analisar o resultado da árvore filogenética percebemos que, dentro de cada serotipo, as estirpes de colonização e as estirpes clínicas estão muito próximas. Em suma, os nossos resultados permitem-nos concluir que: i) a percentagem de crianças saudáveis colonizadas com H. influenzae é elevada; ii) as principais estirpes em circulação são NTHi; iii) a vacina contra o Hib é eficaz, pois o número de isolados deste serotipo em circulação é residual; iv) as estirpes responsáveis por colonização assintomática são genotipicamente muito semelhantes, às estirpes responsáveis por doença invasiva. Conseguimos ainda detetar e caracterizar o locus capsular identificado na estirpe de H. parainfluenzae. O locus encontra-se incompleto, pois em comparação com o locus da cápsula de H. influenzae apenas as regiões I e III coincidem. A região II não coincide com nenhum dos serótipos de H. influenzae, sendo composta por um gene semelhante ao Hif (fcs1), por um gene descrito em H. parainfluenzae (pcsB) e por três genes com homologia em Haemophilus haemolyticus (dltC, dltA e xcbB). A descrição deste locus em H. parainfluenzae tem uma elevada relevância epidemiológica, se tivermos em consideração que esta bactéria normalmente não apresenta cápsula e a cápsula é um dos principais fatores de virulência descritos. Analisando a literatura disponível, apenas um trabalho reporta a deteção do locus capsular em estirpes de H. parainfluenzae, sendo que esse locus foi detetado em quatro estirpes diferentes. É necessário que se mantenha a vigilância ativa das estirpes de colonização em circulação de forma a detetar atempadamente alterações na epidemiologia de H. influenzae.Haemophilus influenzae is a Gram-negative pleomorphic microorganism. Humans are the only known host for this bacterium, and interaction occurs mainly through asymptomatic nasopharyngeal colonization. However, H. influenzae can sometimes lead to serious infections. H. influenzae can be grouped regarding the presence or absence of a polysaccharide capsule being classified into typeable (or capsulated) or non-typeable (NTHi). Capsulated strains can be further classified into six serotypes (a to f) according to the composition of the polysaccharide capsule. These strains are considered the most virulent, particularly H. influenzae serotype b (Hib). Hib used to be not only the most frequently characterized, but also the cause of the most severe infections. Therefore, a vaccine against Hib was implemented. The vaccine was effective against this serotype; however, it was responsible for a change in the epidemiology of H. influenzae, with NTHi strains being nowadays the major serotype found in circulation. Besides that, the vaccine also had an effect in the non-b serotypes, leading to an increase in the number of isolates of other serotypes especially related with infection. Despite all the information that exists regarding the epidemiology of H. influenzae, most studies are done with invasive strains, and there are no studies, in Portugal, that address the colonization by this bacterium in healthy individuals. Thus, one of the objectives of this work was to understand the epidemiology of H. influenzae circulating in the community in Portugal. For that, we isolated and characterized H. influenzae strains from samples previously collected from healthy children attending day-care centers in the Lisbon region. Using selective culture plates, we isolated 764 (out of a total of 891 nasopharyngeal samples) putative H. influenzae and, through conventional PCR, we determined the presence or absence of a capsule, as well as characterized the specific serotype, for all isolates. We also searched for production of β-lactamases, across all isolates, and determined the Minimum Inhibitory Concentration (MIC) of a broad spectrum of antimicrobials in the capsulated and in the β-lactamases producing strains. Results obtained were compared with similar results from clinical isolates. As some cases of Hib have been reported in Portugal over the last few years, the second objective of this work was to compare colonization and disease and verify if there was any genetic proximity between invasive and non-invasive strains. For this purpose, we performed whole genome sequencing (WGS) of all capsulated strains (n=19). Two strains with potential epidemiological interest were also analyzed. Using appropriate software, we determined the sequence type (ST) of each isolate and analyzed the presence and absence of 105 virulence genes. We found that the presence and absence of virulence genes is related to the capsular serotype, with serotype b strains having the highest number of virulence genes (n=91). We proceeded to the in silico detection of genes associated with resistance and found β-lactamases encoding genes in three of the analyzed strains. In addition, we also identified a β-lactamase positive amoxicillin clavulanate resistant (BLPACR) strain with changes in the amino acids of penicillin binding proteins type 3 (PBP3), that could justify its resistance phenotype. We also compared our results with the ones obtained with invasive strains, particularly regarding the occurrence of SNPs between them. We were then able to conclude that: i) the proportion of potential carriers of H. influenze among healthy children younger than 6 years old attending day-care centers in the Lisbon region is high (85.9%); ii) most isolates in circulation are NTHi; iii) the number of serotype b isolates in circulation is very low (0.1%); iv) colonization isolates are genetically closely related to clinical isolates. In addition, we have identified and characterized a new cap locus, encoding for capsular biosynthesis, in a Haemophilus parainfluenzae isolated during this work.Leão, Raquel SáCunha, Mónica VieiraRepositório da Universidade de LisboaCavaco, Luís Filipe Paulino2023-11-09T01:31:38Z202020202020-01-01T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/47737TID:202607593enginfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2023-11-13T01:17:43Zoai:repositorio.ul.pt:10451/47737Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T21:59:44.254837Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse
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