Restoring cholesterol homeostasis in neurons by cyp46a1 does not stall the progression of niemann-pick type C disease

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Reis, Joana Pinheiro Leite da Anunciação
Data de Publicação: 2022
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: eng
Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
Texto Completo: http://hdl.handle.net/10451/62941
Resumo: Tese de mestrado, Ciências Biofarmacêuticas, 2022, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia.
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spelling Restoring cholesterol homeostasis in neurons by cyp46a1 does not stall the progression of niemann-pick type C diseaseNiemann-Pick Type C disease (NPC)Cholesterol 24-hydroxylase (CYP46A1)Brain cholesterol metabolismNeuroinflammationAutophagyTeses de mestrado - 2022Ciências da SaúdeTese de mestrado, Ciências Biofarmacêuticas, 2022, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia.A enzima colesterol 24-hidroxilase (CYP46A1) consiste num citocromo P450 neuro-específico, que catalisa a conversão do colesterol em 24S-hydroxycholesterol, constituindo a principal via de eliminação do colesterol no encéfalo. Tem assim um papel crucial na manutenção do normal metabolismo do colesterol, tendo em conta que o encéfalo é o órgão do corpo humano com maior teor de colesterol. Em estudos prévios do nosso grupo, em que foram utilizados diferentes modelos celulares da doença de Niemann-Pick type C (NPC), o CYP46A1 foi sugerido como um potencial alvo terapêutico nesta patologia. Isto deve-se à capacidade do CYP46A1 em corrigir a acumulação de colesterol não-esterificado nos endossomas tardios /lisossomas (LE/L), que constitui a principal característica da doença de NPC. Este fenótipo é originado por mutação na proteína NPC1, localizada na membrana dos LE/L, e responsável pelo efluxo e reciclagem do colesterol internalizado sob a forma de lipoproteínas. A doença de NPC é uma doença rara, com alternativas terapêuticas muito limitadas. A sintomatologia que a caracteriza é diversa e afeta o encéfalo, fígado e o baço. Na maioria dos casos, a doença manifesta-se durante a infância ou início da adolescência, sendo que os pacientes apresentam um comprometimento progressivo da função motora e intelectual, que geralmente levam à morte nas duas primeiras décadas de vida. Entre as alterações patológicas neuro-viscerais, um sintoma principal da doença de NPC é a ataxia cerebelar, que é resultante da perda progressiva de células de Purkinje. O mecanismo responsável pela perda neuronal acentuada não se encontra ainda definido, porém, o desequilíbrio induzido pela acumulação de colesterol é frequentemente tido em conta como agravante, senão mesmo a causa da doença. De facto, a desregulação da homeostase do colesterol está subjacente ao processo neurodegenerativo, induzindo um bloqueio do fluxo autofágico e um aumento da neuro-inflamação. Desta forma, o objetivo deste trabalho foi avaliar se a expressão do CYP46A1 promove a melhoria do fenótipo da doença, com foco nas principais características patológicas, incluindo a desregulação da homeostase do colesterol, neuro-inflamação e bloqueio da autofagia. Para isso, aumentámos os níveis de CYP46A1 utilizando vírus adeno-associados, num modelo murganho da doença de NPC. Estes animais, Npc1tm(I1061T), possuem o knock-in da mutação I1061T no gene que codifica para a proteína NPC1, que é a mais frequente encontrada nos humanos. Os nossos resultados mostraram que a expressão ectópica de CYP46A1 impediu parcialmente a perda de peso e a hepatomegalia observada os murganhos NPC. Além disso, o CYP46A1 promoveu uma correção significativa dos níveis de mRNA de genes envolvidos na síntese, captação, efluxo e esterificação do colesterol. A este efeito, foi também associada uma promoção da redistribuição do colesterol não esterificado acumulado nos LE/L, que foi sugerida através da análise por marcação de cortes parasagitais do córtex dos animais com filipina III. A partir destes resultados, foi possível concluir que as células do cerebelo e córtex dos animais NPC estão de facto a responder à normalização da homeostase do colesterol promovida pela expressão do CYP46A1. Outra característica impactante da doença de NPC é a neuro-inflamação, que é evidenciada pela ativação de microglia, que inicia uma cascata neurodegenerativa e leva à ativação de astrócitos. A expressão de CYP46A1 corrigiu parcialmente os níveis de mRNA aumentados de alguns marcadores de microglia característicos de um fenótipo mais pró-inflamatório no cerebelo dos murganhos NPC, e em simultâneo induziu um aumento dos níveis de expressão de Arginase 1 e do Fator de Transformação do crescimento β1. Esta alteração do perfil inflamatório da microglia foi corroborada por ensaios de imunohistoquímica, em que foram analisados os níveis da molécula adaptadora de ligação ao cálcio 1 (Iba-1), em várias regiões do cerebelo dos murganhos, nomeadamente o núcleo cerebelar profundo e as camadas molecular e granular dos lóbulos do cerebelo, e que sugerem uma diminuição da ativação da microglia por parte do CYP46A1. No entanto, não foi observada nenhuma melhoria relativamente ao perfil de ativação de astrócitos. Concomitante com a correção da homeostasia do colesterol, foi também registado um restabelecimento dos níveis de mRNA da enzima lisosomal Catepsina D o que sugere uma melhoria parcial da desregulação lisossomal caraterística da doença de NPC. Visto que a disfunção lisossomal está associada aos defeitos na autofagia verificados nesta doença, foram efetuados estudos in vitro recorrendo a células HeLa em que foi efetuado o knock-down da proteína NPC (NPC-KO). O aumento da expressão do CYP46A1 com recurso a transdução com vectores de adenovírus, confirmaram os resultados previamente obtidos pelo nosso grupo no modelo animal NPC, ao indicar que a expressão de CYP46A1 promove a restauração do fluxo autofágico. Este efeito foi observado através de uma redução na acumulação da forma lipidada da proteína 1 de cadeia leve 3 associada a microtúbulos (LC3-II), bem como através da análise dos níveis de mRNA de genes envolvidos na regulação da autofagia. Embora uma melhoria das várias características patológicas principais da doença de NPC tenha sido registada em resposta à expressão de CYP46A1, a degeneração das células de Purkinje não foi revertida no cerebelo dos murganhos NPC. Esta análise decorreu do cálculo da densidade de células de Purkinje após marcação dos tecidos com Violeta de Cresil e posterior confirmação através de marcação com um anticorpo anti-Calbindina através de imunofluorescência. Os resultados apresentados neste estudo demonstram que a correção da homeostase do colesterol mediada por CYP46A1 em murganhos NPC não é suficiente para prevenir a morte de células neuronais, realçando o papel de outros lípidos neurotóxicos na etiologia desta doença. No entanto, a expressão de CYP46A1 promoveu a reversão de importantes aspetos patológicos da doença, nomeadamente a normalização do metabolismo do colesterol, regularização do fluxo autofágico e diminuição da neuro-inflamação. Sendo estes aspetos característicos também de variadas outras doenças neurodegenerativas, o CYP46A1 poderá então representar uma abordagem terapêutica válida em diferentes contextos.Cholesterol 24-hydroxylase (CYP46A1) is a neuronal-specific cytochrome P450, which catalyzes the major elimination pathway of brain cholesterol, through its conversion into 24S-hydroxycholesterol. Our previous studies in different models of Niemann-Pick type C disease (NPC) suggested CYP46A1 to be a potential therapeutic target, since the ectopic expression of this protein could correct the unesterified cholesterol accumulation in late endosome/lysosomes (LE/L) characteristic of this disease. The deregulation of cholesterol homeostasis is the main hallmark of this fatal neurodegenerative and lysosomal storage disorder, leading to autophagic flux impairment and neuroinflammation. The goal of the present work was to evaluate how CYP46A1 ectopic expression in the Npc1tm(I1061T) animal model is improving the disease phenotype, by focusing on the main pathologic hallmarks, cholesterol homeostasis dysregulation, neuroinflammation, and autophagy impairment. Increased expression of CYP46A1 by adeno-associated virus-mediated gene therapy in NPC mice partially prevented weight loss and hepatomegaly. Additionally, CYP46A1 corrected the transcript levels of genes involved in cholesterol synthesis, uptake, efflux, and esterification, also promoting a redistribution of the cholesterol accumulated in the LE/L. In NPC, neuroinflammation is first evidenced by microglia activation that begins a neurodegenerative cascade, leading to astrocytosis. CYP46A1 expression partially corrected the increased levels of pro-inflammatory markers along with a decrease of Anti-ionized calcium-Binding Adapter Molecule 1 (Iba-1) immunostaining in NPC mice cerebellum, suggesting CYP46A1 is decreasing microgliosis. However, no CYP46A1-dependent effect was observed in astrogliosis. Moreover, expression of this cholesterol hydroxylase was able to partially rescue lysosomal deregulation, by restoring Cathepsin D mRNA levels in NPC animals. In vitro studies in HeLa NPC-KO cells confirmed previous results obtained in the NPC animal model, showing that CYP46A1 restores the autophagy flux, as observed by a reduction in the accumulation of lipidated microtubule-associated protein 1 light chain 3 (LC3-II), as well as by autophagy-related transcriptome analysis. Although several pathological features were improved in response to CYP46A1 expression, Purkinje cell degeneration was not reversed in the cerebellum of NPC mice. Overall, this work further characterizes the effect of CYP46A1 in ameliorating important pathological features of NPC and highlights that correction of cholesterol accumulation is not sufficient to halt neurodegeneration in NPC.Fundação para a Ciência eTecnologia (FCT); Bolsa de Investigação da Sociedade Portuguesa de Doenças Metabólicas (SPDM)Nunes, Maria João de JesusRodrigues, Elsa Margarida TeixeiraRepositório da Universidade de LisboaReis, Joana Pinheiro Leite da Anunciação2022-12-132022-10-282025-12-13T00:00:00Z2022-12-13T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/62941TID:203198689enginfo:eu-repo/semantics/embargoedAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2024-03-04T01:19:39Zoai:repositorio.ul.pt:10451/62941Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-20T03:12:26.368097Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse
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