Tradução independente de cap da proteína humana up-frameshift 1 (UPF1) e cancro

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Bacalhau, Neuza Sofia Augusto Silva
Data de Publicação: 2021
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: por
Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
Texto Completo: http://hdl.handle.net/10451/51949
Resumo: Tese de mestrado, Oncobiologia, Universidade de Lisboa, Faculdade de Medicina, 2020
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spelling Tradução independente de cap da proteína humana up-frameshift 1 (UPF1) e cancroExpressão génica eucarióticaIniciação da traduçãoTradução independente da estrutura capLocal interno de entrada do ribossoma (IRES)UP-Frameshift 1 (UPF1)Domínio/Área Científica::Ciências MédicasTese de mestrado, Oncobiologia, Universidade de Lisboa, Faculdade de Medicina, 2020A regulação da síntese proteica desempenha um papel crítico no crescimento celular. O início da tradução é fortemente regulado por uma concentração equilibrada de fatores envolvidos na síntese das proteínas e é considerada um passo limitante da síntese proteica. Na maioria dos casos (tradução canónica), o início da tradução é um mecanismo dependente de cap, que se inicia com o recrutamento da subunidade 40S do ribossoma e vários fatores de iniciação, para a estrutura cap, localizada na extremidade 5’ do mRNA. De seguida, este complexo denominado 48S, faz a leitura de toda a região 5’ transcrita não-traduzida (UTR, do inglês untranslated region) até atingir o primeiro codão de iniciação em contexto de Kozak favorável. Contudo, vários transcritos, entre os quais oncogenes, fatores de crescimento e proteínas envolvidas na regulação da morte celular programada, conseguem manter os seus níveis de expressão proteica em circunstâncias que condicionam a iniciação canónica da tradução. Este mecanismo alternativo de iniciação da tradução ocorre sem a necessidade de reconhecimento da estrutura cap e/ou de leitura da 5’UTR. Como exemplo, temos a tradução independente de cap mediada por um local interno de entrada do ribossoma (IRES, do inglês internal ribossome entry site). A tradução mediada por IRES requer várias proteínas atuando em trans, conhecidas como ITAF (do inglês IRES trans-acting factor). Este mecanismo envolve o recrutamento direto do ribossoma para a vizinhança do codão de iniciação sem o envolvimento da estrutura cap. Este mecanismo não-canónico de iniciação da tradução pode sustentar a síntese proteica sob condições de stress e promover/combater a tumorigénese. A up-frameshift 1 humana (UPF1, do inglês up-frameshift 1) é uma proteína-chave envolvida no mecanismo de degradação rápida de ácidos ribonucleicos mensageiros (mRNA do inglês messenger ribonucleic) portadores de mutações nonsense (NMD, do inglês nonsense-mediated mRNA decay), replicação e homeostase de telómeros, e progressão do ciclo celular, desempenhando por isso um papel crucial na célula. Resultados anteriores do grupo de investigação onde desenvolvi este trabalho mostram que esta proteína tem a capacidade de ser traduzida de forma independente de cap, mediada por IRES, em condições normais, mas também em condições prejudiciais à iniciação da tradução canónica, como hipóxia ou stress do retículo endoplasmático, em linhas celulares de cancro do colo do útero e colorretal. Na presente dissertação, propusemos caracterizar o significado biológico da tradução mediada pelo IRES existente na 5’UTR de UPF1. Para tal, testámos a relevância da xiv tradução independente de cap de UPF1 em mecanismos em que esta é crucial, tal como o NMD, através do silenciamento de UPF1 endógeno recorrendo a siRNA digiridos à 3’UTR de UPF1 e promovendo a tradução de UPF1 de forma independente de cap recorrendo a mRNA transcritos in vitro a partir dos plasmídeos em estudo. Os resultados do silenciamento de UPF1 foram bastante eficazes, no entanto, não foi possível obter resultados com diferenças significativas entre os níveis de expressão de mRNA controlo e mRNA com o IRES da 5’UTR de UPF1. É necessário utilizar um plasmídeo dicistrónico para obter resultados mais fiáveis relativamente à funcionalidade biológica de UPF1 traduzida via IRES cujas clonagens já foram conseguidas. Acreditamos que os resultados obtidos são o primeiro passo para uma melhor caracterização de UPF1 traduzida via IRES, podendo este mecanismo ser bastante útil no desenvolvimento de novas terapias no combate ao cancro.Abstract The regulation of protein synthesis plays a critical role in cell growth. The start of translation is strongly regulated by a balanced concentration of factors involved in protein synthesis and is considered a limiting step in protein synthesis. In most cases (canonical translation), the onset of translation is a cap-dependent mechanism, which begins with the recruitment of the 40S subunit of the ribosome and various initiation factors, to the cap structure, located at the 5 'end of the mRNA. Then, this complex called 43S, reads the entire 5 'transcribed untranslated region (5’UTR) until it reaches the first initiation codon in the context of favorable Kozak. However, several transcripts, including oncogenes, growth factors and proteins involved in the regulation of programmed cell death, manage to maintain their levels of protein expression in circumstances that condition the canonical initiation of translation. This alternative translation initiation mechanism occurs without the need to recognize the cap structure and / or to read the 5'UTR. As an example, we have the independent translation of cap mediated by an internal ribosome entry site (IRES). IRES-mediated translation requires several trans-acting proteins, known as ITAF (IRES trans-acting factor). This mechanism involves the direct recruitment of the ribosome to the vicinity of the initiation codon without the involvement of the cap structure. This non-canonical translation initiation mechanism can support protein synthesis under stress conditions and promote / combat tumorigenesis. The human up-frameshift 1 (UPF1) is a key protein involved in the mechanism of rapid degradation of messenger ribonucleic acids (mRNA from the messenger ribonucleic) carrying nonsense mutations (NMD) mRNA decay), telomeric replication and homeostasis, and cell cycle progression, therefore playing a crucial role in the cell. Previous results from the research group where I developed this work show that this protein has the ability to be translated independently of cap, mediated by IRES, under normal conditions, but also under conditions that are harmful to the initiation of canonical translation, such as hypoxia or stress of the endoplasmic reticulum, in cervical and colorectal cancer cell lines. In this dissertation, we proposed to characterize the biological meaning of the translation of the IRES existing in the 5'UTR of UPF1. To this end, we tested the relevance of the independent translation of UPF1 cap in mechanisms in which it is crucial, such as NMD, by silencing endogenous UPF1 using siRNA digested at UPF1 3'UTR and promoting the translation of UPF1 independently from cap using mRNA xvi transcribed in vitro to from the study plasmids. The results of the UPF1 silencing were quite effective, however, it was not possible to obtain results with significant differences between the levels of expression of control mRNA and mRNA with the UPF1 5'UTR IRES. It is necessary to use a dicistronic plasmid to obtain more reliable results regarding the biological functionality of UPF1 translated via IRES, whose cloning we have already concluded. We believe that the results obtained are the first step towards a better characterization of UPF1 translated via IRES, and this mechanism can be very useful in the development of new therapies to fight cancer.Loison, Luísa Maria Ferreira RomãoCasimiro, Sandra Cristina Cara de AnjoRepositório da Universidade de LisboaBacalhau, Neuza Sofia Augusto Silva2022-03-24T12:38:09Z2021-06-172021-06-17T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/51949TID:202752704porinfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2023-11-08T16:56:57Zoai:repositorio.ul.pt:10451/51949Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T22:03:08.431702Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse
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